新研究分享 | 河南猪场GIII型盖塔病毒增强毒力变异株流行情况

2024年7月至9月，河南省多个养猪场发生盖塔病毒（GETV）集中暴发。从31个猪场分离27株病毒，其中22株在系统发育树中形成独特簇，nsP3和E2蛋白出现氨基酸突变。

实验表明，该GIII变异株在仔猪中致病性显著增强，致死率达100%，在小鼠中也表现出高致病性。本研究首次对河南猪场GETV大规模暴发进行了系统调查，揭示了GIII变异株的增强毒力及其分子特征。

盖塔病毒（GETV）是一种单股正链RNA病毒，可感染多种动物，甚至可能威胁人类。2024年7月至9月，河南省商品猪场发生GETV集中暴发，从中分离出27株病毒，其中GIII变异株为主要致病株，毒力较早期株增强。本研究为了解GETV的分子流行病学和致病特征提供了参考。

本研究使用BHK-21和PK-15细胞培养猪源GETV分离株HNJZ-S1，采集河南和山西猪场疑似感染样本提取病毒核酸并合成cDNA，通过PCR/RT-PCR检测病毒。阳性样本在细胞中分离、纯化并鉴定，测定病毒生长特性和空斑形成，E2基因及全基因组经扩增、克隆和测序后进行序列比对与系统发育分析。

动物实验中，GETV阴性仔猪和2日龄SPF乳鼠分别肌肉或皮下注射病毒，观察临床症状或死亡情况，并检测血液和组织病毒载量。病毒RNA通过组织样本提取并合成cDNA后，用SYBR Green qPCR检测，数据以平均值±标准差表示并用GraphPad Prism 9.0分析。

1. GETV样本收集与病毒检测

2024年7月，河南驻马店某养猪场3～10日龄仔猪发生高死亡率疫情，发病率30%，死亡率80%，经实验室确认由单一GETV毒株引起。随后，河南多地猪场出现疑似GETV疫情，采集临床样本统计显示，18个地市中12个、157个县中21个发现疫情（图1(a)）。7月至9月分别发生1起、15起和16起疫情。仔猪主要症状为严重腹泻、共济失调和后肢无力，尸检显示淋巴结肿大出血、肺出血、散在体表出血点及皮下水肿（图1(b)）。在36份GETV阳性样品中，仅2份合并感染PDCoV、PCV2或JEV，其余均为单一GETV感染（图1(c)）。

图1. 河南猪场GETV疫情概况

（a）河南省GETV阳性猪场分布图。 （b）本次疫情中感染仔猪的大体组织病变。

（c）组织样本中GETV及其他病毒的PCR鉴定。

结论：河南省多地猪场仔猪发生GETV感染，以单一病毒为主，临床表现为腹泻、共济失调和后肢无力，少数样本存在混合感染。

2. GETV的分离鉴定与滴度测定

从36份阳性样品中，在BHK-21细胞中成功分离出28株GETV，其中HNzk-XH1和HNzmd-XP1经鉴定确认为GETV。感染BHK-21或PK-15细胞48小时后，与对照相比可见明显细胞病变，包括细胞皱缩、变圆和脱落。RT-PCR和电子显微镜进一步证实了病毒特性。增殖曲线显示，两株病毒的生长动力学相似，滴度在感染后36小时达到峰值，随后下降。斑块实验结果表明，两株病毒斑块大小相近，但数量存在差异。

图2. GETV的分离和特性分析

（A）HNzk-XH1或HNzmd-XP1感染BHK-21和PK-15细胞后，在12至36小时内可见细胞病变。

（B）通过RT-PCR鉴定GETV分离株。 （C）用电子显微镜检查GETV颗粒的形态。

（d）HNzk-XH1或HNzmd-XP1在BHK-21和PK-15细胞中的生长情况。 （e）GETV在BHK-21细胞上的噬斑形态。

结论：从猪场样品中成功分离出GETV毒株HNzk-XH1和HNzmd-XP1，两者在细胞中均能引起明显病变，具有相似的生长动力学和滴度变化，但斑块数量存在差异。

3. 序列测定与系统进化分析

本研究获得的全基因组序列（GenBank登录号：PQ658739～PQ658750）和E2基因序列（GenBank登录号：PQ658751～PQ658766）已提交至GenBank。全基因组同源性分析显示，分离株间核苷酸一致性为98.4%～100.0%，氨基酸一致性为99.3%～100.0%。与参考株相比，这些分离株与GI、GII、GIV和GIII的核苷酸一致性分别为94.8%～95.0%、96.9%～97.0%、95.6%～97.3%和96.9%～99.8%，氨基酸一致性分别为98.5%～98.8%、98.9%～99.1%、98.3%～99.5%和98.7%～100.0%。

基于28个分离株E2基因和12个全基因组的系统进化分析表明，所有分离株均归属于GIII，与其他分组关系较远（图3(a,b)），其中大多数与GDHYLC23变体聚为一支(图3(b))。氨基酸序列比对发现，这些分离株在nsP3和E2蛋白中存在4个特有突变(图3(c))，其中nsP3的P329S突变位于ZBD区域，A381T和V503G突变位于HVD区域，E2蛋白在323位点发生D323E突变。基于这些特征，可确定该分支分离株为GIII变异株。

图3. 分离株的系统发育分析和氨基酸序列比对。基于E2（a）和完整基因组（b）的分离株系统发育分析。

结论：本研究的分离株均属于GIII型，与其他组亲缘关系较远，并在nsP3和E2蛋白上具有特有氨基酸突变，确定这些分离株为GIII变异株。

4. GETV HNzk-XH1株对仔猪的致病性

由于商品猪场GETV疫情死亡率高，且从BHK-21和PK-15细胞分离的GETV病毒滴度较高，本研究选取滴度较高的HNzk-XH1毒株进行致病性评价。攻毒组仔猪肌肉注射10⁷TCID₅₀的HNzk-XH1毒株，对照组注射等量DMEM培养基。攻毒后24小时，攻毒组仔猪出现腹泻，1.5天后出现后肢麻痹，2天后有仔猪死亡，4天内所有仔猪死亡，死亡率达100%（图4(c)）。临床症状评分显示，HNzk-XH1组症状明显严重于对照组（图4(b)）。死亡仔猪立即解剖，对照组在8天后解剖。观察发现，HNzk-XH1组仔猪小肠壁显著变薄，内容物为黄色水样，而对照组小肠正常（图4(a)）。RT-qPCR检测显示，攻毒组2天采集的血液中GETV nsP1基因拷贝数接近10⁶/ml，对照组未检测到病毒（图4(d)）。对仔猪肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、小肠和脑组织的检测结果显示，HNzk-XH1感染组各器官均存在高病毒载量，而对照组未检测到GETV RNA（图4(e)）。

图4. 仔猪致病性表现

（a）感染仔猪的临床症状和尸检结果。  （b）感染仔猪的临床评分。

（c）感染仔猪的存活率。  （d）感染仔猪感染后第2天全血中病毒RNA水平。

（e）感染后死亡仔猪不同器官中病毒RNA水平。

结论：HNzk-XH1毒株对仔猪致病性极高，可迅速引起严重临床症状和全群死亡，病毒在血液及主要器官中广泛存在，对照组未见异常。

5. 乳鼠感染HNzk-XH1变异株的病理变化

研究表明，乳鼠是研究GETV毒力的理想模型。实验结果显示，HNzk-XH1变异株感染乳鼠可引起后肢瘫痪、生长迟缓（图5(a)），并在不同剂量下导致快速死亡；相比之下，HNZJ-S1株致死性较低，低剂量感染的乳鼠可存活且体重增长正常，显示两株在乳鼠中的致病性存在明显差异。

图5. HNzk-XH1与HNZJ-S1致病性比较

（a）乳鼠感染临床症状。 （b）HNzk-XH1毒株不同感染剂量乳鼠存活率。

（c）HNZJ-S1毒株不同感染剂量乳鼠存活率。 （d）HNzk-XH1毒株不同感染剂量乳鼠体重变化。

（e）HNZJ-S1毒株不同感染剂量乳鼠体重变化。

结论：HNzk-XH1变异株在乳鼠中致病性高，可引起后肢瘫痪、生长迟缓并快速死亡；HNZJ-S1株致病性较低，低剂量感染乳鼠可存活且体重正常，表明两株毒力存在明显差异。

本研究表明了2024年7月至9月，河南省猪场GETV集中暴发的病毒被鉴定为GIII组的独立分支变异株，E2和nsP3蛋白上存在四个独特氨基酸突变。与早期分离株相比，该变异株毒力增强，并可能通过猪与蚊子在疫情爆发前已悄然传播。气候条件和猪场流通模式加速了疫情蔓延，目前中国尚无疫苗，需要加强监测并及时调整防控策略。