出色设计 + 优质数据：蛋白质组学研究设计指南（含 PEA 技术深度解析）

什么是 PEA 及其工作原理

邻位延伸分析（PEA）技术创新性地融合了抗体检测的特异性与 DNA 技术的高灵敏度，为蛋白质生物标志物发现提供了理想工具，将亲和力依赖的蛋白质测量技术提升至全新高度。该技术由 Olink Proteomics AB 公司商业化，广泛应用于 Olink 生物标记物 Panel 开发，通过将双重识别免疫测定与实时定量 PCR（qPCR）或二代测序（NGS）读数技术结合，实现了可扩展、超多重且高特异性的蛋白质定量检测，单次实验即可准确定量数千种蛋白质生物标记物（图 1至 图 4 为 PEA 技术机制与核心优势示意图）。

图 1. PEA技术读取前的主要步骤

具体工作流程（图 1）：

• 标记有 DNA 寡核苷酸的特异性抗体对，在溶液中与目标抗原特异性结合；

•  结合后处于邻位的两条 DNA 寡核苷酸链发生杂交，随后在DNA 聚合酶作用下进行延伸反应；

• 新生成的含特异性条码的 DNA 片段，通过 PCR 扩增后，可采用 NGS 或 qPCR 技术进行读取与定量分析。

技术突破点（图2）：传统免疫分析法进行多重检测时，易因抗体交叉反应导致结果偏差，而PEA 技术通过双重抗体识别与 DNA 条码标记的双重特异性验证，有效规避了交叉反应干扰，显著提升检测准确性。

图2. 克服多重免疫检测的局限性

超高通量优势（图3）：PEA 技术的扩增子分子设计包含一个正向和一个反向DNA 条码，该部分条码包含检测 ID 信息。第三部分 DNA 条码包含样本 ID 信息。仅需 2μL 血浆或血清样本，即可同时完成超过5000 余种蛋白质的检测，大幅降低样本消耗的同时提升检测效率。

图3. 通过 NGS读取每个蛋白和样品的条码

PEA 技术的内置质量控制体系（图 4）:

为确保检测数据的可靠性与稳定性，PEA 技术建立了覆盖全流程的内置质量控制体系，对实验各环节进行严格监控：

• 样本对照品：用于评估实验的重复精度，确保同一样本检测结果的一致性；

•  阴性对照：精准测量每种蛋白质及整个样品板的背景信号水平，排除非特异性结合干扰；

• IPC / 板间对照：用于不同检测板间数据的归一化处理，消除板间差异，保障多板实验数据的可比性；

• 全流程质控节点：涵盖免疫结合、DNA 延伸、PCR 扩增 / 检测等关键步骤的专项质控，全面监控实验流程的稳定性。

图4. PEA的质量控制体系

PEA如何解决蛋白质组学的历史性挑战

蛋白质组学研究长期面临灵敏度不足、特异性欠佳、样本消耗量大、动态范围有限四大核心难题，PEA 技术通过独特设计实现了全方位突破（图 5、图 6）：

• 双重抗体识别增强特异性：需一对特异性抗体同时结合目标抗原才能启动后续反应，大幅降低非特异性结合概率，解决了传统方法特异性不足的问题；

•  PCR 扩增提升灵敏度：通过对目标信号的 PCR 扩增放大，实现低至 fg/mL 级别的蛋白质定量检测，突破传统免疫检测的灵敏度瓶颈；

• 优化设计降低样本消耗：采用高效的反应体系设计，样本需求量≤6μL，完美适配微量样本研究场景；

• 超宽动态范围覆盖：可检测的蛋白质浓度范围跨越 10 个数量级（fg-mg 级别），覆盖从低丰度细胞因子到高丰度结构蛋白的全范围检测需求，解决了蛋白质组学研究中动态范围有限的难题。

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图5. Olink PEA如何解决蛋白质组学的历史性挑战

图6. PEA的动态范围

精准设计：提升蛋白质组学研究功效，获取可转化数据

学习目标

• 明确研究问题对研究方案设计的导向作用

• 掌握提升蛋白质组学研究功效的核心策略

蛋白质组学研究问题

研究问题决定了研究计划的核心框架与技术路径，蛋白质组学的应用场景广泛（图 7），不同研究目标对应差异化的设计方案：

• 遗传学研究：通过 pQTL（蛋白质数量性状位点）分析，借助蛋白质组学数据解析基因与蛋白质表达的关联机制；

• 临床预测：预测疾病进展轨迹及患者对治疗方案的响应程度，为精准医疗提供依据；

• 疾病早筛：发现疾病早期特异性生物标志物，实现疾病的早期诊断与干预；

• 标志物发现：挖掘新的疾病相关生物标志物及风险因子，为疾病机制研究与药物开发提供靶点。

图7. 蛋白质组学的应用实例

蛋白质组学研究流程概述和方案设计

标准化研究流程（图 8）:

从研究问题出发，遵循 “研究计划→研究设计→研究执行→统计分析→可操作数据” 的完整流程：

• 研究计划阶段：明确研究目标、筛选检测靶点、进行功效分析；

• 研究设计阶段：确定实验设计类型、样本分组策略、随机化方案；

• 研究执行阶段：完成样本选择、规范收集与处理、样本检测分析；

• 统计分析阶段：结合质量控制数据，进行专业的统计建模与差异分析，最终输出可转化的研究结论。

图8. 从研究的问题到可操作的数据：蛋白质组学研究流程概述

研究方案设计（图 9）:

根据研究规模、时间维度及研究目的，可选择适配的设计方案：

• 小规模研究：单块检测板完成，通常包含 44 例病例与 44 例对照，设计简洁且效能明确，适用于初步探索性研究；

• 大型研究：多块检测板并行检测，样本量充足，统计功效高，适用于验证性研究或大规模人群研究；

• 连续研究：分批次处理样本，每批次数据可用于指导后续批次的分析方向，适用于逐步深入的探索性研究；

• 纵向研究：追踪同一患者多个时间点的样本，核心目标是分析蛋白质表达随时间的变化规律，适用于疾病进展监测或治疗效果评估研究

图 9. 不同蛋白质组学研究设计方案

研究设计的核心目标:

• 最大化统计功效：通过合理增加样本量，提升检测组间差异的概率；

• 最小化实验变量：通过标准化操作、随机化分组、设置对照等方式，减少生物学差异与技术差异对结果的干扰。

研究功效的关键认知与优化策略

研究功效的定义:

研究功效是指在给定效应值的前提下，正确检测出研究组间差异的概率。其核心影响因素包括：

• 效应值大小：即研究组间差异的标准化度量，取决于实际差异幅度及数据的标准差，是影响功效的核心因素；

• 样本量：样本量与研究功效呈正相关，合理增加样本量可提升功效；

• 数据分布特征：组间数据重叠程度越高，效应值越小，所需样本量越大才能达到相同功效。

  

图 10. 研究的效应值大小和功效

效应值与样本量的关系（图 10、图 11):

• 高效应值场景：当实验组与对照组数据几乎无重叠，组间差异显著时，即使样本量较小，也能获得较高的研究功效；

• 低效应值场景：当组间数据重叠部分大于差异部分，效应值较小时，需大幅增加样本量才能保证足够的研究功效，以确保准确检测到真实差异；

• 常规设计标准：多数研究设计为 80% 的统计功效，即有 80% 的概率检测到组间的真实差异。

图 11. 对照组和实验组之间的功效计算示例

提升研究功效的实用技巧:

• 样本量优化：若各组样本量不均衡，优先增加最小组的样本量，可更高效地提升整体研究功效；

• 实验设计优化：采用配对设计（如自身前后对照），可有效减少个体生物学差异性，显著提升功效；

• 聚焦核心因素：效应值对功效影响最大，设计阶段可通过精准定义研究指标、减少数据变异，间接提升效应值；

• 大规模研究质控：开展多批次、跨时间点的大规模研究时，采用随机化分组或设置桥接样本，是保障数据可合并分析的关键；

• 专业支持获取：可向 Olink 数据科学团队咨询，获取个性化的研究功效分析建议；

• 工具辅助设计：利用 Olink 免费提供的功效计算工具（Olink Insight — Study Size Calculator），精准估算所需样本量，优化研究设计。

结语

本期推文系统梳理了 PEA 技术的核心原理、优势及质控体系，同时详解了蛋白质组学研究设计的关键逻辑与功效优化策略，为大家构建了从技术核心到实践应用的完整知识框架。这是我们蛋白质组学技术干货系列的开篇内容，后续将持续推出更具针对性的深度分享 —— 包括蛋白质组学实验设计的精细化规划、数据深度挖掘的实用方法、Olink 相关工具的 step-by-step 操作指南等。关注我们，获取前沿技术干货，助力您的蛋白质组学研究高效推进！