Olink蛋白组学联合单细胞RNA检测解析细胞新奥秘

• mRNA检测：采用改进的Smart-seq2实验方法进行单细胞RNA测序。该操作步骤包括在细胞裂解缓冲液中添加额外的去污剂以确保获取核蛋白，使用寡聚dT连接的T1 Dynabeads固定（poly(A)）mRNA部分，并在逆转录反应前省略72°C的热步骤以避免变性细胞蛋白。
  
• 蛋白检测：采用多重邻位延伸分析（PEA）技术进行蛋白测量。研究人员与Olink公司合作开发了一款探索性的多重PEA panel，用于单细胞分析，涉及96种蛋白质，并专注于研究感兴趣的胞内蛋白。该panel包括与多能性、神经发生、细胞周期期和代谢功能相关的不同功能组的蛋白质。在该panel中的96种蛋白质中， 89种蛋白在单个细胞中可被检测到。
  
• 实验流程：培养人胚胎干细胞并诱导神经分化，在特定时间点收集细胞。单细胞经染色、流式分选到含不同成分的缓冲液中。通过寡聚 dT 磁珠捕获 mRNA，进行逆转录和预扩增，同时处理蛋白质样本用于 PEA 分析。构建测序文库并测序，对数据进行处理和分析。
  

• 检测技术：开发了同时检测单细胞中大量蛋白和RNA靶点的方法。蛋白检测运用Olink PEA 技术；RNA 检测采用商业 TaqMan 基因表达分析方法。
• 实验模型：以胶质母细胞瘤细胞系 U3035MG 为研究对象，用 BMP4 处理细胞，在处理前和处理6天后收集单细胞，检测RNA和蛋白水平。
  

研究结果

• 方法学可靠性评价：蛋白和RNA检测方法可靠、重复性好。蛋白检测的平均变异系数为 12.2% ，RNA 检测在不同细胞数量下变异系数也在可接受范围。

• RNA与蛋白表达的相关性：单细胞水平上，RNA 和蛋白质表达相关性差，决定系数平均仅 0.04。不过，部分蛋白 - RNA 对存在显著正相关，但共表达动态不同。如 PLAU 蛋白常见，但 RNA 仅在少数细胞中可测，体现出 RNA 瞬态性和蛋白质稳定性差异。

• BMP4处理后的细胞反应：U3035MG 细胞对 BMP4 反应存在异质性。BMP4 激活了相关反应基因，降低了神经干细胞标记物的表达，但未诱导终末分化，部分细胞向神经元命运分化。此外，处理组细胞中，增殖标记物高表达的细胞还具有间充质特征，表明部分细胞能逃避 BMP4 的分化作用，维持增殖状态。

• RNA和蛋白区分细胞状态的能力：蛋白测量在区分 BMP4 处理组和未处理组细胞方面表现更优，不过 RNA 和蛋白数据结合使用能提供更高的区分度。

• 技术原理：开发了整合 PEA 和 cDNA 合成的方法，利用逆转录酶的 DNA 聚合酶活性，在同一反应中进行PEA分析和 cDNA 合成。
• 实验流程：在捕获位点分离单个细胞，裂解后加入PEA探针，进行 DNA 聚合反应，同时延伸 PEA 探针的寡核苷酸并逆转录 RNA 为 cDNA。通过多重预扩增PCR扩增DNA 报告分子，最后用高通量 qPCR 或测序分析蛋白和 RNA 靶点。
• 实验模型：使用人乳腺癌细胞系MCF7，在含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养。细胞分别用1μM佛波酯（PMA）处理0小时、24小时和48小时后，收集细胞进行后续实验。

• 检测方法性能评估：通过检测重组蛋白和细胞群体裂解物稀释液，评估了 PEA/STA 反应性能。多数蛋白和 RNA 检测在单细胞水平呈线性响应，确定了检测灵敏度和线性范围，筛选出可靠的探针用于后续分析。
• 单细胞水平的检测验证：以 PMA 刺激的 MCF7 细胞为模型，用 RNA-FISH 和 IF 染色验证 C1 系统检测的准确性。结果表明，虽原位检测更灵敏，但 PEA/STA 能提供单细胞蛋白质和 RNA 丰度的线性和多重信息。
• RNA和蛋白表达关系：PCA 和随机森林预测算法显示，蛋白质在区分 PMA 处理组和未处理组细胞上表现更优，蛋白质和 RNA 数据结合能更好地区分细胞。RNA 和蛋白表达相关性分析发现，二者相关性受多种因素影响，PMA 刺激后相关性分布发生变化，且不同基因的相关性变化各异。
• 基因表达调控机制：对 MET 基因的研究发现，其蛋白和RNA水平的相关性变化与剪接变体有关，提示 MET 蛋白丰度可能受翻译调控。此外，通过对 CASP8 相关通路的分析，发现不同时间点相关基因的富集功能不同，揭示了 PMA 刺激下细胞状态的变化。
  
  组合PEA/STA工作流程的基准测试：AXIN1和MKI67