问题解读 | 细胞复苏常见问题及解决方案【收藏】

目录

• 1.细胞复苏常见问题及解决方案

      Q1：为什么细胞解冻复苏后活力低？

      Q2：为什么细胞复苏后，很多难以贴壁

      Q3：细胞复苏后，为什么状态越来越差，生长缓慢？

• 2.细胞复苏的技巧

 

1. 细胞复苏常见问题及解决方案

Q1：为什么细胞解冻复苏后活力低？

A1：这种现象可能由以下原因所致：

1）冻存液质量：使用质量不佳的冻存液可能会影响细胞存活率。

解决方案：选择最合适的细胞冻存保护剂。细胞冻存液分为有血清冻存液和无血清冻存液。有血清的冻存液组分可以按照培养基：血清：DMSO=7:2:1比例来配制，冻存液需提前配制并置于4℃预冷2小时以上以防止DMSO稀释时放热导致冻存液温度过高损伤细胞活力，且需确保冻存液所有组分均无微生物污染。也可选择市面上大品牌的无血清冻存液。

 

2）细胞冻存前的状态：细胞冻存前代次高、状态不佳

解决方案：购买的细胞在细胞状态好的低代次时应进行冻存保种。冻存前，需确认细胞处于对数生长期（细胞汇合度约80%），贴壁细胞贴壁良好且细胞形态正常，悬浮细胞应镜检观察细胞形态饱满无明显碎片，细胞活力90%以上。冻存前一天应对细胞进行换液处理。

 

3）冻存温度梯度：在冻存过程中，温度变化过快可能会导致细胞损伤

解决方案：应将细胞冻存管放入细胞程序降温盒中，并置于-70℃冰箱中过夜保存。此时冻存管中细胞按照1℃/min的速度来降温。

 

4）冻存细胞储存温度：冻存细胞储存的温度不合适

解决方案：冻存细胞在经过-70℃冰箱程序降温过夜后应尽快转移至液氮中长期保存，以确保较大的细胞活性。同时避免细胞冻存管直接浸没液氮中，如果将细胞直接浸入液氮中，容易造成液氮泄露到冻存管内，解冻时会有冻存管爆炸的风险。所以一般储存在液氮上方的气相环境中较好。

 

5）细胞解冻方法：细胞解冻方法不当

解决方案：细胞迅速从液氮中取出后，应尽快（2min内）置于干净的一次性PE手套内（防止水浴锅中水进入冻存管内引起细胞污染）并使冻存管浸没于37℃水浴锅中，轻柔晃动使其快速融化。待冻存管内仅有少量冻存物未融化时即可从水浴锅中取出，尽快在生物安全柜中转移至温热的完全培养基中，300g*5mmin低速离心，去除DMSO。

 

Q2：为什么细胞复苏后，很多难以贴壁

A2：这种现象可能由以下原因所致：

1）细胞冻存时消化处理不当

解决方案：细胞如果在冻存前消化时间过长，可能会导致细胞复苏时失去贴壁能力。此时可以适当缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度来减少影响。细胞在消化时，应加入适量胰酶，严格控制消化时间，注意观察瓶底细胞如果轻轻敲击即有约80%细胞脱落时，应立即加入适量的含血清的完全培养基终止消化。

 

2）细胞复苏时操作不当

解决方案：细胞复苏融化后应尽快轻轻混匀后转移至离心管中，低速短时间（一般300g*3min左右）离心后，弃上清后，缓慢加入适量培养基轻柔吹打使细胞分散并转移至培养内。此时的冻存细胞经过低温冷冻后细胞极易破碎，一定要保证低速离心，且吹打混匀时动作一定要轻柔，否则细胞很容易破裂，会影响细胞贴壁及状态。

 

3）细胞培养条件不合适

解决方案：首先需要确认细胞培养基是否正确，是否需在CO2条件下培养。复苏后的培养条件不适宜也会影响细胞存活。确保培养环境的温度、湿度和CO2浓度稳定。需要在CO2条件下培养的贴壁细胞，必须要保证复苏后置于合适浓度的CO2培养箱中培养，否则会导致细胞不贴壁或者贴壁缓慢。

 

4）细胞微生物污染

解决方案：细胞在冻存前或者复苏时由于无菌操作不合格，导致细胞被微生物污染，通常是细菌、真菌或者支原体等。当污染严重时，会引起细胞不贴壁或者状态变得极差。细胞在操作处理时，一定要严格执行无菌操作，同时要注意保证使用的细胞培养相关试剂是无菌的。细胞需要定期取样进行微生物污染检测，实验室需定期进行常规消杀。

 

Q3：细胞复苏后，为什么状态越来越差，生长缓慢？

 A3：在排除了上述细胞冻存复苏过程的种种原因以及细胞培养条件是否合适和微生物污染外，这种现象可能由以下原因所致。

 

 1）基因敲除细胞自身原因导致

 解决方案：对于某些基因敲除细胞，复苏后细胞状态逐渐变差且一直生长缓慢甚至不长，在排除了上文所有原因后，可能是敲除基因的影响。某些基因是对于细胞生长增殖的必需基因，敲除后会严重影响细胞正常生长或者增殖的通路，从而导致细胞生长缓慢及状态越来越差。

 对于这类必需基因的敲除，都可联系粒曼生物帮助您进行基因必需性分析及敲除风险评估。同时我司还提供大量生物信息学数据帮助客户更好地理解基因功能以及推荐KO/KD 方案，助您成功且轻松得到理想的敲除细胞。

 

2）基因敲入稳转细胞表达产物的影响

解决方案：对于某些基因敲入稳转细胞（过表达细胞），复苏后在表达产物的量/浓度积聚较高时，可能会因为其表达产物本身对增殖细胞的生长增殖具有毒性或者是干扰细胞生长增殖的信号通路等而影响细胞的正常生长和增殖。遇到这种情况，可以考虑换一种表达的宿主细胞，比如如果该表达产物对于293细胞有较大细胞毒性，可以考虑换用其他细胞来作为宿主细胞或者选择可调控该产物表达的方案重新构建细胞。

 粒曼生物拥有多种基因敲入（过表达）稳转细胞系构建方案及表达产物验证方法，随机插入、定点插入、原位插入、可诱导表达系统等方案，满足您各种过表达细胞需求，同时助力您科研路上更轻松省心省时。

 

2、细胞复苏的技巧、

细胞冻存与复苏的过程中，一个关键的原则就是“慢冻快融”。

• 细胞冻存时，如果直接将细胞暴露在非常低的温度下，比如直接放入-196℃的液氮罐中，细胞内外的水会迅速结冰。这一过程中，胞外溶液中的水会先于胞内水结冰，导致胞外溶液不断浓缩，细胞内水分通过渗透作用移出细胞，进而引起细胞电解质升高、渗透压改变、脱水及蛋白质变性等。这些变化会对细胞造成机械性损伤，导致细胞死亡。

•  

为了避免这一问题，需要采取缓慢降温的策略。通过缓慢降温，可以使细胞有足够的时间通过渗透作用排出水分，同时胞外溶液的冰晶形成也更为细小，减少了冰晶对细胞的损伤。此外，在冻存液中加入抗冻剂（如DMSO）可以降低冰点，增加细胞渗透压稳定性，进一步保护细胞免受损伤。粒曼推出无DMSO冻存液产品（联系销售），对脆弱的免疫细胞、干细胞、原代细胞及iPS细胞等更加友好！

 

• 细胞复苏解冻时需要快速升温。在解冻过程中，如果升温时间过久，细胞外的冰晶融化速度缓慢，则会形成较大的冰晶颗粒，这些冰晶颗粒可能会对细胞进行损伤，甚至进入细胞内部，形成再结晶，对细胞造成二次损伤。

 

此外，DMSO在常温下对细胞具有较大的毒副作用，如果解冻时间过长，DMSO会对细胞造成损害。因此，细胞解冻时需要快速升温，通常在1-2分钟内将细胞从-196℃的液氮中融化至37℃。这一过程需要在水浴锅中进行，以确保温度均匀上升。同时，解冻后需要迅速稀释DMSO的浓度，减少对细胞的损伤。

 

• 细胞在冻存时，需要缓慢降温。

图1：细胞复苏流程图

以下是一些细胞复苏的技巧，帮助大家提高复苏细胞的存活率和复苏效果。

• 快速解冻：将冻存管从液氮罐中取出后，立即放入37℃的水浴中，快速摇动，使其在1-2分钟内完全融化。快速解冻可以防止冰晶形成，减少细胞损伤。
• 避免温度剧烈变化：在复苏过程中，尽量避免温度的剧烈变化，以减少对细胞的压力。从液氮罐中取出冻存管时，可以先放在-80℃冰箱中几分钟，然后再进行解冻。
• 无菌操作：在解冻和处理细胞时，确保操作环境无菌。使用75%酒精擦拭冻存管外部，防止污染。
• 去除冷冻保护剂：解冻后，将细胞悬液缓慢加入含有培养基的离心管中，低速离心去除冷冻保护剂。然后用新鲜培养基重悬细胞，确保细胞完全混匀。
• 逐步适应培养环境：将解冻后的细胞逐步适应培养环境。初始培养时，可以使用较低的细胞密度，24小时后更换新鲜培养基，去除死细胞。
• 观察细胞状态：定期观察细胞的形态和贴壁情况。复苏成功的细胞应具有正常的形态特征，并能迅速贴壁。
• 优化培养条件：确保培养环境的温度、湿度和CO2浓度稳定，避免剧烈变化。
• 添加生长因子：在培养基中添加适量的合适的生长因子或补充剂，可以促进细胞的快速恢复和增殖。