Western Blot Q＆A

Western Blot Q & A

问题1：蛋白条带出现“微笑条带”

可能原因及解决办法：

l 迁移速度过快：降低电泳电压，以降低迁移速度。

l 缓冲液温度过高：实验前提前将缓冲液放入4℃冰箱冰浴；可使用Hoefer SE260垂直电泳仪搭配冷却循环泵实现精准控温。

问题2：条带弥散或非特异性条带

可能原因及解决办法：

l 蛋白样本上样量过多：减少样本上样量。

l 抗体浓度过高：降低抗体浓度，特别是一抗浓度。

l 化学发光底物的信号太强：缩短曝光时间；降低底物浓度。

问题3：目的蛋白条带信号弱

可能原因及解决办法：

l 组织或细胞中目的蛋白含量低：增加蛋白上样量。

l 蛋白样本裂解不充分：超声裂解有利于蛋白释放，建议制备样本时，加入裂解液后使用超声破碎裂解样本，尤其是核蛋白。

l 抗体浓度过低/孵育不充分：增加抗体浓度，抗体可能对目标蛋白的亲和性差；延长孵育时间

l 洗膜过度：洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.05% 的弱去垢剂 Tween- 20。

l 一抗与二抗不匹配：针对一抗种属选择正确的二抗。

问题4：目的蛋白大小与预期不符

可能原因及解决办法：

l 蛋白样本降解：在样本缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。

l 蛋白翻译后剪切或修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化、甲基化等：查阅文献，验证是否有多条带报道。

l 目标蛋白有多个异构体或剪切体：查阅文献，验证是否异构体报道；检查免疫原序列，判断抗体是否识别异构体或剪切体。

问题5：背景出现不均匀的白色斑点

可能原因：转印不完全，转印时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均匀。

解决办法：

l 在转印过程中，使用凝胶滚筒滚压转印膜组，确保凝胶和膜充分接触。

l 根据制造商的说明，润湿和活化膜。

l 抗体孵育时保持摇动，确保抗体与膜充分接触。

问题6：背景过高

可能原因及解决办法：

l 抗体浓度过高：降低一抗和/或二抗的浓度。

l 对非特异性位点的封闭不充分：适当延长孵育时间，或更换合适的封闭液，如5%脱脂奶粉、3% BSA或血清；在封闭缓冲液中加入 Tween 20 去垢剂可以帮助减少背景。然而，过多的Tween 20会干扰抗体的结合。终浓度为 0.05% 吐温通常效果理想。

l 漂洗不充分：增加漂洗次数。

l 丽春红自发荧光：若使用荧光检测，免疫染色前要完全去除丽春红，因为丽春红会自发荧光。

l 化学发光底物过强：缩短曝光时间；降低底物浓度。

问题7：背景有黑色斑点

可能原因及解决办法：

l 一抗或二抗的浓度过高可能导致非特异性结合，形成斑点：优化抗体稀释比例，从推荐浓度开始进行梯度优化。

l 样品或试剂污染：确保样品及试剂的新鲜度，避免反复冻融；使用经过滤的缓冲液。

l 洗涤不充分：增加洗涤次数或延长洗涤时间；适当提高洗涤液中Tween-20的浓度（推荐浓度为0.05%）。