智立中特OAR-L1绵羊肺成纤维细胞培养指南

       OAR-L1 绵羊肺成纤维细胞系分离自健康绵羊的肺组织，经过严格的筛选和传代培养，具有典型的成纤维细胞形态和稳定的生物学特性，是进行绵羊相关疾病研究（特别是呼吸系统疾病）、兽用疫苗开发与评价、比较医学、组织工程及转基因动物研究等领域不可或缺的体外模型。

核心特性

1. 来源清晰： 明确来源于健康绵羊肺组织。

2. 形态典型： 贴壁生长，呈长梭形或星形，具有成纤维细胞的典型形态特征（胞体伸展，胞质丰富，核卵圆形）。

3. 生长稳定： 在适宜的培养条件下，增殖能力良好，生长曲线稳定可靠。

4. 种属鉴定确证： 通过STR分析等方法确证为绵羊来源。

5. 无菌无污染： 经过严格检测，确保无细菌、真菌、支原体等污染。

6. 应用广泛： 适用于绵羊呼吸系统病原体（如绵羊肺炎支原体、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒等）的感染机制研究、抗病毒药物筛选、疫苗免疫效果评价、细胞因子表达分析、组织修复机制探索及作为基因操作的受体细胞等。

标准化培养方案 (智立中特推荐)

为帮助研究人员高效、稳定地培养 OAR-L1 细胞，获得最佳实验结果，我们提供以下详细的标准化培养指南：

一、 培养前准备

• 培养基： 推荐使用 DMEM/F12 基础培养基，添加 10% 优质胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素-链霉素双抗溶液 (100 U/mL 青霉素 & 100 μg/mL 链霉素)。也可根据具体实验需求（如无血清培养），选择经过验证的专用培养基（需优化）。

• 培养器皿： T25或T75细胞培养瓶、培养皿、多孔板等，预先用0.1%明胶或适宜细胞外基质（如胶原蛋白）包被可促进细胞贴壁和伸展。

• 其他试剂： 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、无菌PBS缓冲液 (pH 7.4)、细胞冻存液（推荐含90% FBS + 10% DMSO）。

• 培养环境： 37°C 恒温，饱和湿度，5% CO2 培养箱。

二、 细胞复苏

1. 快速解冻： 从液氮罐中取出冻存管，立即置于 37°C 水浴中，轻轻摇晃直至细胞悬液完全融化（约1-2分钟）。

2. 转移与稀释： 在生物安全柜中，将细胞悬液缓慢转移到含 5-10mL 预温完全培养基的15mL离心管中。

3. 离心清洗： 800-1000 rpm (约100-150g) 离心 5分钟，小心弃去上清液（含DMSO）。

4. 重悬接种： 用适量新鲜完全培养基轻柔重悬细胞沉淀，接种到包被好的培养器皿中（推荐复苏密度：1-2 x 10^4 cells/cm²）。

5. 初始培养： 将培养器皿放入培养箱，24小时内避免频繁移动观察，让细胞充分贴壁。次日可更换新鲜培养基，去除未贴壁细胞和碎片。

三、 细胞传代

1. 观察时机： 当细胞融合度达到 80%-90% 时进行传代（密度过高会导致细胞状态下降）。

2. 清洗： 弃去旧培养基，加入适量无菌PBS轻轻润洗细胞表面1-2次，去除残留血清（血清会抑制胰酶活性）。

3. 消化： 加入适量0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（覆盖瓶底即可），室温或37°C孵育 1-3分钟。密切显微镜下观察，当细胞间隙增大、形态变圆但尚未大量脱落时（切勿过度消化！），立即加入等体积或2倍体积的含血清完全培养基终止消化。

4. 吹打收集： 用移液管轻柔吹打瓶壁，使细胞完全脱离并分散成单细胞悬液。将悬液转移至离心管。

5. 离心清洗： 800-1000 rpm 离心 5分钟，弃上清。

6. 重悬计数与接种： 用新鲜完全培养基重悬细胞，进行细胞计数。按 1:3 至 1:4 的比例（或根据实验需求调整）接种到新的包被好的培养器皿中。加入足量培养基（如T25瓶加5-6mL）。

7. 培养： 放回培养箱，通常24小时内细胞可重新贴壁伸展。

四、 细胞冻存

1. 选择细胞： 选择处于对数生长期、状态良好、融合度约80%-90% 的细胞。

2. 消化收集： 按传代步骤1-5操作，获得细胞沉淀。

3. 配制冻存液： 用预冷的冻存液（90% FBS + 10% DMSO）重悬细胞沉淀，调整细胞密度至 5 x 10^6 至 1 x 10^7 cells/mL。轻柔混匀。

4. 分装： 迅速将细胞悬液分装至标注清晰的冻存管中（每管1.0-1.5mL）。

5. 程序降温： 使用程序降温盒或遵循“慢冻”原则：将冻存管置于4°C冰箱30分钟 -> 转移至-20°C冰箱2小时 -> 转移至-80°C冰箱过夜 -> 次日转入液氮气相（或直接放入液氮）长期保存。切勿直接将细胞从室温放入-80°C或液氮！

关键注意事项

• 无菌操作： 所有操作必须在生物安全柜或超净工作台内进行，严格无菌操作。

• 试剂质量： 使用高质量的培养基、血清和消化酶，不同批次血清需预先测试。

• 温和操作： 吹打、离心等操作需轻柔，避免机械损伤细胞。

• 及时传代： 避免细胞过度生长融合（>95%），否则细胞容易老化、状态变差甚至脱落。

• 定期检测： 建议定期进行支原体检测（如PCR法），确保细胞无污染。

• 记录： 详细记录细胞代数、传代日期、操作人、培养基批次等信息。

---

应用前景

OAR-L1 绵羊肺成纤维细胞作为重要的绵羊体外模型，在多个前沿领域具有广阔的应用价值：

• 绵羊呼吸系统疾病研究： 研究病原体（病毒、细菌、支原体）感染机制、宿主免疫应答、炎症反应通路。

• 兽用疫苗与药物开发： 评估疫苗候选株的免疫原性、抗病毒/抗菌药物的体外药效与毒性。

• 比较医学与转化研究： 作为人类肺部疾病（如纤维化、感染）研究的比较模型。

• 组织工程与再生医学： 探索肺组织修复机制，作为生物支架的种子细胞来源。

• 基因编辑与转基因研究： 作为CRISPR/Cas9等基因操作技术的受体细胞，用于绵羊基因功能研究和遗传改良模型构建。

• 环境毒理学： 评估空气污染物、粉尘等对绵羊呼吸道上皮及间质的毒性效应。

　　智立中特（武汉）生物科技有限公司主要致力于质粒微生物资源的保护、共享和持续利用，围绕我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展等重大需求，探索、发现、收集国内外的微生物资源，妥善长期保存管理；在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供质粒载体物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。旗下质粒载体网zlzt.com是一款提供质粒载体展示及定制的专业型网站，由智立中特（武汉）生物科技有限公司联合多家企业公司科研院校共同打造！主要展示了各种基因类型下的质粒载体！

　　我们的工作主要包括：广泛分离、收集、保藏、交换和供应各类微生物质粒菌种；保存用于专利程序的各种可培养生物材料；质粒载体类保藏技术研究；微生物分离、培养技术研究；微生物鉴定和复核技术研究；保藏菌种的资料情报收集和提供及编辑微生物菌种目录。