pWB980穿梭质粒的全面介绍与高效培养指南

一、 pWB980穿梭质粒：结构精妙、应用广泛的分子工具

        pWB980是分子生物学和微生物遗传学研究中一款经典的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒，因其稳定的复制特性和便捷的筛选标记，成为基因克隆、表达、启动子分析及蛋白分泌研究的理想载体。其主要特征如下：

1. 核心结构：

   • 复制起点 (Origin of Replication, ori): 同时携带适用于大肠杆菌 (oriE) 和枯草芽孢杆菌 (oriB) 的复制起点，实现双宿主自主复制。

   • 筛选标记 (Selection Markers):

     • 红霉素抗性基因 (Erythromycin Resistance, Emᴿ): 在枯草芽孢杆菌宿主中提供筛选压力。

     • 氨苄青霉素抗性基因 (Ampicillin Resistance, Ampᴿ): 在大肠杆菌宿主中提供筛选压力。

   • 多克隆位点 (Multiple Cloning Site, MCS): 位于 lacZα 片段内，包含多个单一限制性内切酶识别位点，便于外源DNA片段的定向插入。

   • lacZα 肽段 (lacZ Alpha Fragment): 与特定大肠杆菌宿主菌株(如DH5α)表达的ω片段互补，可实现 α-互补蓝白斑筛选。插入外源片段破坏α肽功能，使重组菌落呈白色，未重组质粒菌落呈蓝色，极大简化重组子的鉴定。

2. 关键特性：

   • 穿梭能力 (Shuttle Functionality): 核心价值所在，便于在遗传背景清晰、操作简便的大肠杆菌中进行分子克隆构建，再转移到具有独特生理特性的枯草芽孢杆菌中进行功能研究或表达。

   • 拷贝数 (Copy Number): 在大肠杆菌中为高拷贝质粒，利于质粒DNA的大量制备；在枯草芽孢杆菌中通常为低拷贝质粒，稳定性较好。

   • 大小 (Size): 约 5.5 kb (具体大小可能因不同来源的序列略有差异)，属于中小型质粒，操作方便。

   • 应用范围 (Applications):

     • 枯草芽孢杆菌基因功能研究 (过表达、敲除互补、启动子活性分析等)。

     • 枯草芽孢杆菌中异源蛋白的表达与分泌研究。

     • 构建枯草芽孢杆菌基因文库。

     • 在大肠杆菌中进行分子克隆操作。

二、 智立中特(武汉)生物科技有限公司：您的pWB980培养专家

智立中特深耕生物技术领域，专注于为科研与工业客户提供高品质的分子生物学试剂、工具菌株及专业技术支持。在pWB980的应用方面，我们提供：

• 高品质的pWB980质粒制品： 严格的质控确保高纯度、高浓度、高转化效率。

• 配套的感受态细胞： 提供适用于pWB980转化的大肠杆菌(如DH5α, JM109)及枯草芽孢杆菌(如1A751, WB800系列)高效感受态细胞。

• 优化的培养方案： 基于丰富的经验，提供标准且高效的培养流程。

• 专业的技术支持： 解决您在克隆、转化、表达等环节中遇到的技术难题。

三、 pWB980质粒的培养流程 (大肠杆菌中扩增制备)

以下是在大肠杆菌宿主中进行pWB980质粒扩增和制备的标准流程：

1. 宿主菌选择： 推荐使用支持α-互补的菌株，如 DH5α, JM109, TOP10 等。确保菌株对氨苄青霉素敏感。

2. 转化 (Transformation):

   • 取适量 pWB980质粒DNA (如 1-100 ng) 加入 100 µL 冰上融化的感受态细胞中，轻弹混匀。

   • 冰浴 30分钟。

   • 42°C 热激 45-90秒 (时间需优化，通常90秒)。

   • 立即放回冰浴 2-5分钟。

   • 加入 900 µL 无菌、不含抗生素的LB液体培养基。

   • 37°C, 200-250 rpm, 振荡复苏培养 45-90分钟。

3. 涂板筛选 (Plating and Selection):

   • 取适量复苏菌液(如 50-200 µL)，均匀涂布于含 100 µg/mL 氨苄青霉素 (Ampicillin) 的 LB琼脂平板上。

   • 平板正面向上放置于37°C培养箱中，待菌液吸收后，倒置培养 12-16小时 (过夜)。

   • 若进行蓝白斑筛选，平板中还需加入 IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 和 X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。最终，含空载pWB980的菌落呈蓝色，成功插入外源片段的阳性重组克隆呈白色。

4. 挑菌与过夜培养 (Colony Picking and Overnight Culture):

   • 挑取单个、形态良好的菌落(白色或蓝色，根据实验目的选择)，接种到含 100 µg/mL 氨苄青霉素 的 5 mL LB液体培养基中。

   • 37°C, 250-300 rpm, 振荡培养 12-16小时 (过夜)。

5. 质粒扩增 (Plasmid Amplification - 可选，用于提高产量):

   • 将过夜培养物按 1:100 - 1:500 的比例转接到含100 µg/mL 氨苄青霉素的新鲜LB培养基中 (例如，1 mL 过夜菌液接入100-500 mL LB)。

   • 37°C, 250-300 rpm, 剧烈振荡培养。

   • 当培养物达到对数生长中期至后期 (OD₆₀₀ ≈ 0.6 - 0.8) 时，加入氯霉素 (Chloramphenicol, 终浓度 ~170 µg/mL)。氯霉素抑制宿主蛋白合成和染色体复制，但不抑制松弛型质粒(pWB980)复制，从而显著提高质粒产量。继续培养 12-18小时 (通常过夜)。

6. 质粒提取与纯化 (Plasmid Isolation and Purification):

   • 收集菌体。对于大体积扩增，需离心 (如 4°C, 6000 g, 10-15分钟) 弃上清。

   • 使用商业化质粒提取试剂盒 (如碱裂解法小提、中提或大提试剂盒) 或经典的碱裂解法进行质粒提取。

   • 关键步骤：碱裂解时间要精确控制，避免基因组DNA污染或质粒不可逆变性；中和步骤要轻柔但充分混匀，防止基因组DNA断裂缠绕质粒；离心去除杂质要彻底。

   • 使用RNase A 去除RNA污染。

   • 最终纯化：通常通过试剂盒的硅胶膜吸附洗脱或苯酚/氯仿抽提结合乙醇沉淀获得纯化的pWB980质粒DNA。溶解于TE缓冲液 (pH 8.0) 或无菌超纯水中。

7. 质粒检测与定量 (Verification and Quantification):

   • 琼脂糖凝胶电泳： 确认质粒大小正确，主要为超螺旋形式 (SC)，无严重开环 (OC) 或线性 (L) 污染。

   • 限制性酶切分析： 使用MCS中的酶进行单酶切或多酶切，验证插入片段大小或质粒结构。

   • 分光光度计检测： 测定浓度 (A₂₆₀) 并评估纯度 (A₂₆₀/A₂₈₀ 比值应在 1.8-2.0 之间)。

   • 测序 (Sequencing): 对克隆的插入片段或关键区域进行测序验证，确保序列准确性。

四、 关键注意事项与优化建议

1. 抗生素使用：

   • 大肠杆菌： 严格使用 Amp (100 µg/mL)。氨苄青霉素易降解，平板和液体培养基应新鲜配制，或添加后尽快使用。长期保存菌种需加甘油于-80°C。

   • 枯草芽孢杆菌： 使用 Ery (红霉素, 通常 1-5 µg/mL，具体浓度需根据菌株和实验优化)。红霉素更稳定。

2. 蓝白斑筛选：

   • 确保使用支持α-互补的宿主菌 (如DH5α)。

   • 平板中需添加 IPTG (诱导lac启动子/操纵子表达ω片段) 和 X-Gal (显色底物)。常用浓度：IPTG ~0.1 mM, X-Gal ~40 µg/mL (或按产品说明)。

   • 白色菌落需进一步验证 (酶切、PCR、测序)，避免假阳性。

3. 枯草芽孢杆菌转化： 相比大肠杆菌，枯草芽孢杆菌感受态制备和转化效率通常较低。常用方法包括原生质体法或电转化法。电转化法效率较高，是目前主流方法，需使用专门的电转化感受态细胞和优化的电击参数。转化后需在不含抗生素的复苏培养基中复苏一段时间，再涂布含红霉素的平板。

4. 氯霉素扩增： 该步骤能显著提高质粒产量，尤其对于大体积培养制备质粒。务必在对数中期加入氯霉素，过早加入会抑制生长，过晚效果不佳。

5. 无菌操作： 全程严格无菌操作，避免杂菌污染。

6. 质粒稳定性： pWB980在枯草芽孢杆菌中为低拷贝，长时间传代或在不加选择压力下培养可能丢失质粒。应持续添加红霉素维持选择压力。

结语：

          pWB980穿梭质粒是连接革兰氏阳性模式菌株枯草芽孢杆菌与成熟分子操作平台大肠杆菌的重要桥梁。智立中特(武汉)生物科技有限公司致力于为您提供高质量的pWB980相关产品（质粒、感受态细胞）和专业的培养、应用技术支持，助力您在基因工程、蛋白表达及枯草芽孢杆菌功能基因组学研究中取得突破。掌握其结构特点并遵循标准化的培养流程，是成功应用这一经典载体的关键。