E. coli JM109(DE3)培养指南-智立中特生物

      大肠杆菌（Escherichia coli）因其遗传背景清晰、生长迅速、操作便捷，成为分子生物学和重组蛋白表达的核心宿主。其中，E. coli JM109(DE3) 菌株因其出色的克隆稳定性和可控的T7 RNA聚合酶介导的高效蛋白表达，在实验室和工业应用中备受青睐。

一、 核心遗传特性与优势

1. 卓越的克隆稳定性：

   • endA1 突变： 失活核酸内切酶I，显著提高质粒DNA的产量和质量（尤其适用于质粒提取）。

   • recA1 突变： 失活RecA重组酶，极大降低质粒与外源DNA发生同源重组的风险，保证插入片段的稳定性。

   • hsdR17(rK– mK+)： 具有限制系统(mK+)但缺失修饰系统(rK–)，是克隆含有甲基化DNA（如从哺乳动物细胞中提取的DNA）的理想宿主。

   • supE44： 琥珀突变抑制基因，允许某些携带琥珀突变(amber, TAG)的噬菌体或质粒生长。

   • Δ(lac-proAB)： 缺失部分乳糖操纵子，使其无法利用乳糖。

   • [F' traD36 proAB lacIq ZΔM15]：

     • F' 附加体： 提供接合转移能力（通常实验室克隆不需要）。

     • lacIq： 过表达Lac阻遏蛋白，对未诱导状态下lac启动子驱动的表达有极强的抑制能力。

     • lacZΔM15： 缺失β-半乳糖苷酶的N端片段（α肽），是实现蓝白斑筛选的关键组成部分（需与携带ω肽的载体如pUC系列配套使用）。

2. 可控的高效蛋白表达：

   • DE3 溶原化： 这是JM109(DE3)区别于JM109的核心。它在染色体上整合了λ噬菌体DE3溶原片段，该片段包含：

     • lacI 基因： 提供额外的Lac阻遏蛋白，加强对T7启动子的抑制。

     • T7 RNA 聚合酶基因： 受控于lacUV5 启动子。在未诱导状态下，LacI蛋白结合lacUV5启动子，阻止T7 RNA聚合酶转录。加入IPTG诱导剂后，IPTG结合LacI使其构象改变并从启动子上解离，T7 RNA聚合酶得以表达。随后，T7 RNA聚合酶高效专一地识别并转录目标载体上的T7启动子，驱动下游目的基因的高水平表达。

   • 这种严谨的双抑制系统（宿主自身的lacIq和DE3上的lacI共同抑制T7 RNA聚合酶的表达）极大地降低了目的基因的基础表达（本底泄漏），特别适合表达对宿主有毒性的蛋白。

二、 核心应用场景

1. 常规分子克隆： 质粒构建、扩增、提取（得益于endA1, recA1）。

2. 蓝白斑筛选： 鉴定重组克隆（利用lacZΔM15）。

3. 重组蛋白表达（核心优势）：

   • 利用T7表达系统（如pET系列载体）进行目的蛋白的高水平、可诱导表达。

   • 适用于表达无毒性或中等毒性的可溶性蛋白、包涵体蛋白。

   • 广泛应用于结构生物学、酶学、抗体生产、药物筛选等领域。

三、 E. coli JM109(DE3) 培养指南

1. 培养基：

• 基础培养基： LB (Luria-Bertani) 肉汤或琼脂平板是最常用、最经济的选择。

• 丰富培养基： 如需更高密度培养或表达特定蛋白，可使用TB (Terrific Broth)、2xYT等。

• 抗生素： 根据所携带质粒的抗性标记添加相应抗生素（如氨苄青霉素Amp: 100 μg/mL; 卡那霉素Kan: 50 μg/mL; 氯霉素Cm: 34 μg/mL）。平板和液体培养基中均需添加！

2. 培养条件：

• 温度：

  • 常规生长、克隆扩增： 37°C。

  • 蛋白表达（尤其针对可溶性蛋白）： 常采用较低温度（如 25°C, 30°C, 或 16-18°C）以减缓蛋白质合成速率，促进正确折叠，减少包涵体形成。最佳温度需根据目的蛋白特性优化。

• 振荡/通气： 液体培养需良好通气（摇床转速：200-250 rpm）。

• pH： 标准培养基pH通常为7.0左右，无需特别调节。

3. 感受态细胞制备与转化：

• 常用化学法（如CaCl₂法、RbCl法或商品化试剂盒）制备感受态细胞。

• 转化效率通常可达 10⁶ – 10⁸ cfu/μg pUC19 DNA，满足绝大多数克隆需求。

• 转化后复苏培养（在无抗生素的LB中，37°C，200 rpm，45-60分钟）对表达抗性基因、提高转化效率至关重要。

4. 重组蛋白表达流程（以pET载体为例）：

1. 接种： 挑取单克隆（含目标质粒）接种至含抗生素的LB培养基中，37°C过夜培养（~16小时）。

2. 扩大培养： 按1:100至1:50比例将过夜菌液转接至新鲜含抗生素的LB（或TB/2xYT）培养基中。

3. 生长监测： 37°C, 200-250 rpm 剧烈振荡培养，监测OD₆₀₀。

4. 诱导时机： 当培养物生长至对数中期（OD₆₀₀ ≈ 0.4 – 0.8）时进行诱导。此阶段细胞代谢旺盛，对诱导最敏感。

5. 诱导：

   • 加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至终浓度 0.1 – 1.0 mM（常用0.4-0.5mM起始优化）。

   • 立即改变温度： 将培养物转移至目标表达温度（如25°C, 30°C 或 16-18°C）。

   • 继续振荡培养。

6. 诱导时间： 通常 3-6小时（较高温如30°C）或 16-20小时（低温如16-18°C）。最佳时间需通过时间梯度实验确定。

7. 收获： 离心收集菌体（如4°C, 4000-6000 g, 15-20分钟），弃上清。菌体可立即用于蛋白提取或于-20°C/-80°C保存。

5. 重要注意事项：

• 无菌操作： 所有步骤严格遵守无菌操作规程。

• 抗生素新鲜配制： 水溶性抗生素（如Amp）溶液应过滤除菌，分装，-20°C保存，避免反复冻融。使用时按需加入冷却至~55°C左右的培养基中。卡那霉素、氯霉素相对稳定。

• IPTG浓度与时间优化： IPTG最佳浓度和诱导时间高度依赖于目标蛋白和表达条件，必须进行预实验优化。低浓度IPTG有时能提高可溶性蛋白产量。

• 表达温度优化： 温度是影响蛋白可溶性的关键因素，强烈建议测试不同表达温度。

• 菌株保存：

  • 短期： 穿刺培养或琼脂斜面，4°C保存，可存活数周至数月。

  • 长期： 甘油菌保存是金标准。将对数生长期的菌液与无菌甘油（终浓度15-30%）混合均匀，分装至冻存管，立即置于-80°C保存，可存活数年。避免反复冻融。

• 质粒稳定性： 即使有recA1突变，长期传代或高拷贝质粒在丰富培养基中生长仍可能导致质粒丢失。在无选择压力下培养不宜超过12-15代。保存和扩增时务必添加抗生素。

四、 总结

E. coli JM109(DE3) 凭借其克隆稳定性高（endA1, recA1, hsdR17）、筛选便捷（蓝白斑）、蛋白表达严谨高效可控（T7/lac 系统）的综合优势，成为分子生物学实验室和生物技术产业中不可或缺的工具菌株。掌握其遗传背景和细致的培养优化策略（特别是诱导温度、IPTG浓度和时间），是成功进行基因克隆和重组蛋白表达的关键。智立中特生物愿为您提供优质的JM109(DE3)菌株及相关产品，并提供专业的技术支持，助您在科研与生产的道路上稳步前行。