pUT-mini-Tn5-Km：如何成为微生物基因功能解码的利器？

一、质粒简介
pUT-mini-Tn5-Km 是一种基于转座子 Tn5 的工程化迷你转座子系统，搭载卡那霉素（Km）抗性筛选标记。其核心特征包括：

• 高效转座： Tn5 转座酶介导随机插入，适用于多种革兰氏阴性菌。

• 自杀性载体： 携带 R6K 复制起点，需在表达 π 蛋白的 pir+ 宿主菌（如 E. coli S17-1λpir 或 SM10λpir）中复制；在目标菌中无法自主复制，确保转座事件稳定。

• 卡那霉素抗性： 用于筛选转座成功的突变株。

• 应用广泛： 微生物功能基因组学、致病机制、代谢工程、生物膜研究等核心工具。

二、复苏与培养

1. 复苏（甘油菌）：

   • 取 -80℃ 保存的甘油菌液（含 pUT-mini-Tn5-Km 的 pir+ 宿主菌，如 S17-1λpir）。

   • 冰上解冻或快速置于冰中。

   • 无菌操作，取 50-100μL 菌液划线接种于含 50 μg/mL 卡那霉素（Km） 的 LB 琼脂平板。

   • 平板倒置，30℃ 培养 16-24 小时。（避免 37℃，防止质粒丢失或异常）。

2. 复苏（冻干粉）：

   • 按供应商说明复水，立即划线于含 Km (50μg/mL) 的 LB 平板。

   • 30℃ 培养 16-24 小时。

3. 液体培养：

   • 挑取单菌落接种于含 Km (50μg/mL) 的 LB 液体培养基。

   • 30℃、200-250 rpm 振荡培养至对数中期（OD600 ≈ 0.5-0.8，约 6-8 小时）。

   • 关键点： 必须使用 pir+ 宿主菌，维持 Km 选择压力，严格控制 30℃。

三、操作流程（以接合转移为例）

1. 准备供受体菌：

   • 供体菌： 含 pUT-mini-Tn5-Km 的 pir+ 宿主菌（如 S17-1λpir），按上述方法培养至对数中期。

   • 受体菌： 目标菌株（如 Pseudomonas, Acinetobacter 等），培养至对数中期。

2. 接合杂交：

   • 无菌条件下，等体积混合供体菌液和受体菌液（通常各取 0.5-1mL）。

   • 混合液离心（如 5000 rpm, 2 min），弃上清。

   • 用预热 LB 或无选择培养基轻柔重悬菌体。

   • 取 100μL 混合菌液涂布于 无抗生素的 LB 琼脂平板（或滤膜上）。

   • 平板倒置，30℃ 培养 4-6 小时（或按目标菌接合优化时间）。

3. 筛选转座子：

   • 用无菌刮刀或玻棒将接合菌从平板洗下/刮下，用适量无菌缓冲液（如 PBS）或 LB 重悬。

   • 取适量菌液涂布于含 受体菌筛选抗生素 + Km (50μg/mL) 的双抗性 LB 平板。

   • 在受体菌最适温度下培养 24-72 小时。（仅含 Km 的平板用于验证受体菌无天然抗性）。

4. 验证与保存：

   • 挑取双抗性平板上单菌落进行后续鉴定（见第七部分）。

四、培养注意事项

• 宿主菌： 严格使用 pir+ 菌株（S17-1λpir/SM10λpir）。

• 温度： 维持 30℃，避免 37℃（导致质粒不稳定）。

• 抗生素： 使用新鲜配制或 -20℃ 避光保存的 Km 母液，工作浓度 50 μg/mL。

• 无菌操作： 全程严格无菌，防止污染。

• 生长监测： 液体培养时监测 OD600，确保在对数中期操作（接合效率最高）。

• 受体菌状态： 受体菌需处于活跃生长期（对数中期）。

• 接合条件： 接合时间、温度需根据受体菌特性优化。

五、菌株生长不良排查

1. 宿主菌问题： 确认使用正确的 pir+ 菌株？菌株活力丧失？（重新复苏或更换）。

2. 抗生素失效： Km 是否过期或保存不当？（更换新鲜配制）。

3. 培养温度错误： 是否在 30℃ 培养？避免 37℃。

4. 培养基问题： LB 是否配制正确？是否污染？

5. 接种量不足： 增加接种量或延长培养时间。

6. 质粒丢失： 在无选择压力下传代过多？务必全程添加 Km。

六、污染预防

1. 严格无菌： 超净台操作，提前紫外灭菌，操作时避免说话，勤换枪头。

2. 试剂无菌： 培养基、抗生素溶液需灭菌（0.22μm 滤膜过滤除菌更佳）。

3. 器材灭菌： 培养皿、吸管、试管等彻底灭菌。

4. 操作规范： 酒精灯火焰旁操作，瓶口、管口过火。

5. 环境清洁： 定期清洁消毒工作台及培养箱。

6. 分区管理： 无菌操作区、样品处理区、培养区分开。

7. 及时清理： 废弃培养物立即灭菌处理。

七、质粒/突变株鉴定

1. 质粒提取与酶切： 从供体菌提取质粒，用限制性内切酶（如 EcoRI, HindIII）酶切验证条带大小。

2. PCR 验证： 针对转座子上的 Km 抗性基因或特定引物（如转座酶基因外侧引物）进行 PCR 扩增。

3. 测序： 对转座子插入位点侧翼序列进行测序（常用反向 PCR、TAIL-PCR 或高通量测序），确定插入位置。

4. 表型验证： 通过接合子对 Km 的抗性及受体菌筛选抗生素抗性初步确认；根据研究目的验证突变表型（如毒力、代谢能力变化）。

5. Southern Blot： （经典方法）使用 Km 基因探针验证转座子在基因组中的插入拷贝数（应为单拷贝）。

6. 转座效率测试： 计算接合实验中获得的 Km抗性接合子数量与受体菌总数的比值。

八、保藏与冻存

1. 供体菌保藏（短期）： 穿刺接种于含 Km (50μg/mL) 的 LB 半固体培养基，4℃ 保存，可存活数周。

2. 甘油菌冻存（长期 - 首选）：

   • 取对数生长期菌液，加入无菌甘油至终浓度 15-25%。

   • 轻轻混匀，分装至无菌冻存管。

   • -80℃ 保存，可存活数年。

3. 冻干保藏（长期）： 使用专业冻干机和保护剂（如脱脂奶、海藻糖），冻干后密封避光 4℃ 或 -20℃ 保存，保存期长。

4. 突变株保藏： 同受体菌保藏方法（通常用甘油冻存于 -80℃），需添加 Km (50μg/mL) 维持选择压力。

九、核心应用领域

1. 微生物功能基因组学： 构建饱和突变库，通过筛选表型（抗性、营养缺陷、毒力变化等）鉴定基因功能。

2. 病原微生物研究： 鉴定细菌毒力因子、耐药机制、宿主适应相关基因。

3. 代谢工程与合成生物学： 改造微生物代谢途径，优化产物（生物燃料、药物、化学品）合成。

4. 环境微生物学： 研究微生物在污染物降解、生物修复、元素循环中的作用基因。

5. 生物膜研究： 鉴定调控生物膜形成、分散的关键基因。

6. 共生与互作研究： 探究植物根际、动物肠道等共生体系中微生物的功能基因。

　　智立中特（武汉）生物科技有限公司主要致力于质粒微生物资源的保护、共享和持续利用，围绕我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展等重大需求，探索、发现、收集国内外的微生物资源，妥善长期保存管理；在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供质粒载体物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。旗下质粒载体网zlzt.com是一款提供质粒载体展示及定制的专业型网站，由智立中特（武汉）生物科技有限公司联合多家企业公司科研院校共同打造！主要展示了各种基因类型下的质粒载体！