全面解析A2780+GFP人卵巢癌细胞系：复苏、培养、应用与保藏指南

一、A2780+GFP人卵巢癌细胞系简介

A2780+GFP人卵巢癌细胞系是在经典卵巢癌细胞系A2780基础上，通过基因工程手段（如慢病毒转染）稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的肿瘤模型。GFP标记使其在荧光显微镜或活体成像中可视化，广泛应用于肿瘤生物学研究、药物筛选及转移机制分析。

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二、复苏操作指南

1. 快速解冻：从液氮中取出冻存管，立即置于37℃水浴中摇晃至完全融化（约1-2分钟）。

2. 离心去冻存液：将细胞悬液转移至含5mL预温培养基（如RPMI-1640+10% FBS）的离心管，1000rpm离心5分钟，弃上清。

3. 重悬接种：用新鲜培养基重悬细胞，接种于培养瓶，置于37℃、5% CO₂培养箱。
   注意：避免反复冻融，复苏后24小时内减少晃动以助贴壁。

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三、培养与传代流程

1. 培养基：RPMI-1640基础培养基，添加10%胎牛血清（FBS）、1%双抗（青霉素/链霉素）。

2. 传代步骤：

   • 吸弃旧培养基，PBS轻柔冲洗。

   • 加入0.25%胰酶-EDTA，37℃消化1-3分钟（显微镜下观察细胞回缩）。

   • 加入含血清培养基终止消化，吹打成单细胞悬液，按1:3至1:5比例传代。

3. 换液频率：每2-3天更换培养基，密度达80-90%时传代。

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四、关键注意事项

1. 无菌操作：超净台紫外线消毒30分钟，试剂分装避免污染。

2. GFP稳定性：定期用荧光显微镜检测GFP表达，传代时添加筛选抗生素（如G418，浓度需预实验确定）。

3. 环境控制：CO₂浓度稳定（5%）、湿度＞90%，避免温度波动。

4. 细胞状态监测：贴壁均匀性、GFP荧光强度、增殖速度异常时及时排查。

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五、常见问题与解决方案

1. 生长缓慢：

   • 检查血清批次活性，确保FBS无失活；

   • 调整接种密度（建议2-5×10⁴ cells/cm²）；

   • 排查支原体污染（PCR检测）。

2. GFP信号减弱：

   • 加入筛选压力（如G418）；

   • 避免长期曝光，减少光漂白。

3. 污染预防：

   • 定期消毒培养箱，使用支原体清除剂（如Plasmocin）；

   • 分装试剂，避免多人共用同一批次。

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六、污染防控策略

• 物理隔离：独立操作区域，专用移液器。

• 试剂检测：新批次血清/培养基需无菌试验。

• 定期监测：每月用Hoechst 33342染色检测支原体。

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七、冻存与保藏方法

1. 冻存液配制：90% FBS + 10% DMSO，现用现配。

2. 步骤：

   • 对数生长期细胞消化后离心，重悬于冻存液（密度1×10⁶/mL）；

   • 分装至冻存管，程序降温：4℃ 30min → -20℃ 2h → -80℃过夜 → 液氮长期保存。

3. 复苏存活率：＞80%为合格，需定期复苏检测。

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八、细胞鉴定方法

1. STR分型：通过短串联重复序列分析确认细胞来源。

2. GFP验证：荧光显微镜观察（激发波长488nm）或流式细胞术检测表达率（＞95%为佳）。

3. 功能验证：化疗药物敏感性测试（如顺铂IC₅₀值）与亲本A2780对比。

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九、核心应用领域

1. 抗肿瘤药物筛选：GFP标记便于高通量评估药物对细胞增殖/凋亡的影响。

2. 肿瘤转移研究：活体成像追踪癌细胞在动物模型中的迁移与定植。

3. 基因功能分析：结合CRISPR/Cas9技术研究卵巢癌相关基因。

4. 免疫治疗评估：与免疫细胞共培养，观察杀伤效果。

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十、总结与建议

A2780+GFP细胞系是卵巢癌研究的强效工具，但需严格把控培养条件与污染防控。定期备份冻存、监测GFP稳定性是长期实验成功的关键。