紫色色杆菌CV026：群体感应研究的利器与操作全指南

       紫色色杆菌CV026（Chromobacterium violaceum CV026）是一种基因工程改造的微生物明星，因其独特的紫色色素（violacein）产生能力与群体感应（Quorum Sensing, QS）系统紧密关联，成为研究细菌通讯、生物膜形成及开发新型抗菌策略的核心工具菌株。本文旨在为智立中特(武汉)生物科技有限公司提供一份关于CV026的全面操作与应用指南。

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一、复苏紫色色杆菌CV026

1. 准备工作：超净工作台预先灭菌30分钟，准备好预热的LB液体培养基（或营养肉汤）、无菌吸管、培养皿。

2. 冻存管解冻：从-80℃冰箱取出CV026甘油冻存管，握于手心或置于30℃水浴中快速解冻（约1-2分钟）。

3. 接种：在超净台内打开冻存管，用无菌吸管吸取50-100µL菌液，转移至5-10mL无菌LB液体培养基中。

4. 复苏培养：30℃、200rpm振荡培养18-24小时。菌液应呈现轻微浑浊或淡紫色。

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二、培养紫色色杆菌CV026

• 培养基：LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L）最常用，营养肉汤亦可。

• 培养条件：

  • 温度：30℃（最适，37℃生长较快但色素产生可能减弱）。

  • 氧气：好氧培养。液体培养需振荡（180-220rpm）；固体培养用LB琼脂平板。

  • 时间：通常18-24小时可达对数后期/稳定期早期，紫色色素明显可见。

• 操作步骤：

  1. 从复苏培养物或平板上挑取单菌落，接种于新鲜LB液体培养基。

  2. 30℃振荡培养至所需生长阶段（如OD600≈0.8用于AHL检测实验）。

  3. 如需平板培养，划线或涂布于LB琼脂平板上，30℃倒置培养24-48小时。

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三、培养注意事项与问题解决

• 关键注意事项：

  1. 无菌操作：全程在超净台进行，所有器具、培养基严格灭菌。

  2. 温度控制：维持30℃恒温，温度过高抑制紫色素合成。

  3. 避免剧烈震荡：剧烈振荡可能破坏已产生的紫色素。

  4. 及时转接：长期保存应定期转接新鲜培养基或冻存，避免菌种退化。

• 生长不良怎么办？

  • 检查培养基和温度：确认培养基配制正确、无污染，培养箱温度准确。

  • 检查菌种活性：菌种是否老化？尝试重新复苏或从原始冻存管接种。

  • 检查氧气供应：液体培养振荡速度是否足够？装液量是否过多（一般不超过容器体积的1/5）？

  • 验证功能：使用已知阳性AHL分子（如C6-HSL）验证其诱导紫色素产生的能力是否正常。

• 如何预防污染？

  • 严格无菌技术：是根本。

  • 环境清洁：定期清洁消毒超净台、培养箱、冰箱等。

  • 分装试剂：培养基、抗生素等分装使用，避免反复冻融或长时间室温放置。

  • 规范操作：避免手或衣物越过无菌区域开口，使用无菌吸头/吸管。

  • 及时清理：培养后及时处理废弃菌液和平板（需灭菌）。

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四、核心作用：群体感应报告菌株

CV026的最大价值在于其作为AHL群体感应信号分子的生物传感器：

• 原理：CV026自身不能产生AHL信号分子，其紫色素合成基因的表达严格依赖于外源AHL分子的存在。当环境中存在合适的AHL（特别是短链AHL如C4-HSL, C6-HSL, 3-oxo-C6-HSL等）时，AHL结合并激活其转录调控蛋白CviR，进而启动紫色素合成基因簇的表达。

• 表现：在含AHL的培养基上生长时，CV026菌落或菌液呈现深紫色；无AHL时，菌落呈乳白色或淡黄色。紫色的有无及深浅直观指示AHL的存在与浓度。

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五、菌种保藏与冻存

1. 短期保藏（1-2个月）：

   • 穿刺培养：接种于LB琼脂半固体高层（含0.7%琼脂），30℃培养24小时后，封口膜密封，4℃避光保存。

   • 平板保存：新鲜平板划线培养，生长良好后封口膜密封，4℃避光保存（定期转接）。

2. 长期冻存（数年）：

   • 甘油冻存法（推荐）：

     • 取对数生长期菌液（OD600≈0.8）与无菌60%甘油溶液等体积混合（终浓度30%甘油）。

     • 混匀后分装至无菌冻存管（0.5-1mL/管）。

     • 立即置于-80℃超低温冰箱保存。

   • 冷冻干燥法（更长期，需专业设备）：需使用保护剂（如脱脂牛奶、蔗糖溶液），冻干后密封保存于-20℃或-80℃。

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六、菌株鉴定

• 形态学：革兰氏阴性小杆菌。在LB平板上30℃培养24-48小时，菌落圆形、光滑、湿润、凸起。关键特征：在含适当AHL的平板上产生深紫色色素，无AHL时无色或浅黄。

• 分子生物学（确证）：

  • PCR扩增特定基因：如针对其紫色素合成基因（如vioA, vioB等）或群体感应调控基因（cviI, cviR - 注意CV026的cviI是缺陷的）进行PCR。

  • 16S rRNA基因测序：通用方法，可确认属种（Chromobacterium violaceum）。

• 功能验证（最常用且关键）：使用已知阳性AHL（如纯品C6-HSL）进行诱导实验，观察紫色素产生情况。

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七、应用领域

1. 群体感应机制研究：作为报告菌株，检测、定量研究多种细菌产生的AHL信号分子。

2. 群体感应淬灭（QS Quenching）研究：

   • 筛选能降解或抑制AHL活性的化合物（潜在抗菌剂）。

   • 评估酶（如AHL内酯酶、AHL酰化酶）的淬灭效果。

3. 环境监测：检测环境样本（土壤、水体、生物膜）中的AHL信号分子活性。

4. 植物-微生物互作研究：检测植物根际或植物病原菌产生的AHL。

5. 抗感染策略开发：筛选干扰病原菌QS通路的药物（抗毒力策略）。

6. 生物膜研究：评估QS在生物膜形成中的作用及干预措施。

7. 教学与示范：微生物学、细菌通讯教学的经典实验材料。

8. 抗菌及抗肿瘤活性物质研究：其天然产物紫色素（Violacein）本身具有抗菌、抗肿瘤、抗寄生虫等活性，是药物开发的潜在来源（虽然CV026主要用于报告功能）。