从实验室到活体成像：MC38+luc结肠癌细胞培养、冻存与应用全攻略

一、MC38+luc细胞概述

MC38+luc是一种表达荧光素酶（Luciferase, luc）的小鼠结肠癌细胞系，通过基因工程手段将荧光素酶基因稳定整合到MC38细胞中。该细胞可通过活体成像技术实时追踪肿瘤生长、转移及药物疗效，是肿瘤机制研究、药物筛选和免疫治疗模型的重要工具。

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二、MC38+luc细胞复苏流程

1. 快速解冻：从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃水浴，轻摇至完全融化（约1分钟）。

2. 离心去冻存液：将细胞悬液转移至含5ml预温培养基（如DMEM+10% FBS）的离心管，1000rpm离心5分钟，弃上清。

3. 重悬接种：用新鲜培养基重悬细胞，接种至培养瓶，置于37℃、5% CO₂培养箱。

4. 首次换液：24小时后更换培养基，去除死亡细胞碎片。

注意：避免长时间暴露于DMSO（冻存液），全程无菌操作。

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三、培养条件与传代操作

培养体系

• 培养基：DMEM高糖培养基 + 10%胎牛血清（FBS） + 1%双抗（青霉素/链霉素）。

• 环境：37℃恒温、5% CO₂、饱和湿度。

传代步骤

1. 吸弃旧培养基，PBS轻柔冲洗2次。

2. 加入0.25%胰酶（含EDTA），37℃消化1-2分钟，显微镜下观察细胞回缩变圆后，加入含血清培养基终止消化。

3. 吹打成单细胞悬液，按1:3至1:5比例传代，每3-4天传代一次。

关键点：避免过度消化（影响活性）或消化不足（导致聚团）。

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四、培养常见问题与解决方案

1. 细胞状态差：

   • 可能原因：血清质量不佳、污染、传代比例不当。

   • 对策：更换优质FBS、检测支原体、优化传代密度。

2. 贴壁不良：检查培养瓶表面是否亲水，或提高血清浓度至15%。

3. 增殖缓慢：确保CO₂浓度稳定，避免频繁开关培养箱。

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五、污染预防措施

1. 严格无菌操作：超净台紫外线消毒30分钟，穿戴实验服及手套，试剂瓶口酒精灯灼烧。

2. 定期监测：

   • 细菌/真菌：培养基浑浊或pH骤降，需丢弃污染细胞。

   • 支原体：每月用PCR或荧光染色法检测。

3. 分区域操作：细胞房与分子实验室分区，避免交叉污染。

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六、细胞冻存与保藏

1. 冻存液配制：含90%完全培养基 + 10% DMSO，现配现用。

2. 冻存步骤：

   • 取对数生长期细胞，消化后离心浓缩至1×10⁶/ml。

   • 分装至冻存管，程序降温：4℃（30分钟）→ -20℃（2小时）→ -80℃（过夜）→ 液氮长期保存。

3. 复苏验证：冻存后1周内复苏一管，检测存活率＞80%为合格。

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七、细胞鉴定要点

1. STR分析：验证小鼠来源及细胞系特异性。

2. 荧光素酶活性检测：注射荧光素底物（如D-Luciferin），通过活体成像仪观察发光信号。

3. 形态学观察：贴壁生长，多边形上皮样，边缘清晰。

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八、核心应用领域

1. 肿瘤机制研究：结肠癌增殖、侵袭、血管生成等信号通路分析。

2. 药物筛选：化疗药、靶向药及免疫检查点抑制剂的体内外药效评估。

3. 免疫治疗模型：构建人源化小鼠，评估CAR-T、PD-1抗体等疗效。

4. 转移研究：通过活体成像实时追踪肺、肝转移灶动态。

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九、总结与操作口诀

• 复苏要快：水浴速融，离心去DMSO。

• 培养要稳：血清优质，传代适度。

• 冻存要慢：梯度降温，液氮保安全。

• 应用要广：活体成像，药效一目了然。

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