pCAMBIA1300-35S-PM-mCherry应用指南

pCAMBIA1300-35S-PM-mCherry 是一款专为植物细胞研究设计的双元表达载体，整合了以下核心元件：

1. 35S启动子：来源于花椰菜花叶病毒（CaMV），驱动目的基因在植物细胞中高效组成型表达。

2. PM定位信号：通过添加质膜（Plasma Membrane）靶向信号肽（如N端肉豆蔻酰化修饰序列），将mCherry荧光蛋白精准锚定至细胞膜。

3. mCherry荧光标记：红色荧光蛋白（Ex/Em: 587/610 nm），光稳定性强，适用于长时间活体观测。

4. pCAMBIA1300骨架：含农杆菌T-DNA边界序列（用于植物转化）、潮霉素（Hygromycin）抗性筛选标记（植物）和卡那霉素抗性标记（细菌），兼容农杆菌介导的遗传转化体系。

---

一、操作流程与注意事项

（1）实验操作步骤

1. 载体转化

   • 将载体导入农杆菌（如GV3101）或大肠杆菌（如DH5α），使用卡那霉素（50 μg/mL）筛选阳性克隆。

2. 植物接种与培养

   • 农杆菌侵染法（如叶盘法、花序浸泡法）转化植物组织，潮霉素（20-50 μg/mL）筛选转基因植株。

   • 培养条件：25°C、16h光照/8h黑暗，湿度60%-70%。

3. 荧光诱导与观察

   • 活体样本直接置于共聚焦显微镜下观察，无需固定；激发光波长580 nm，发射光610 nm以上。

（2）培养注意事项

• 无菌操作：超净台内进行植物组织接种，培养基高压灭菌后添加热敏感抗生素。

• 环境控制：避免温度波动＞2°C，光照强度1500-2000 lux，防止光漂白。

• 污染监测：每日检查培养物，若培养基浑浊或出现异常菌落，立即废弃并消毒环境。

---

二、污染预防策略

1. 生物污染

   • 细菌/真菌：使用0.22 μm滤膜过滤液体培养基，操作台定期紫外灭菌30分钟。

   • 支原体：添加Plasmocin（5 μg/mL）至培养液，定期PCR检测。

2. 交叉污染

   • 分装试剂，避免重复冻融；不同载体实验分区操作。

---

三、保藏与冻存方法

1. 短期保存

   • 菌种：穿刺保存于含15%甘油的LB琼脂（4°C，1-2个月）。

   • 植物材料：转基因组培苗4°C暗保存（≤3个月）。

2. 长期冻存

   • 菌种：50%甘油菌液-80°C冻存；植物细胞：液氮冻存（保护剂：10% DMSO + 20%蔗糖）。

3. 复苏

   • 快速解冻后涂布含抗生素平板，避免反复冻融。

---

四、载体鉴定方法

1. 分子水平

   • PCR鉴定：扩增mCherry基因（引物：F: 5’-ATGGCCTCCTCCGAGGAC-3’, R: 5’-TTACTTGTACAGCTCGTCC-3’）。

   • 酶切验证：HindIII/EcoRI双酶切释放约1.5 kb mCherry片段。

   • 测序：确认PM定位序列及读码框正确性。

2. 表型验证

   • 荧光显微镜观察：细胞膜呈现连续红色荧光，与膜染料FM4-64共定位。

---

五、应用领域

1. 植物细胞生物学

   • 实时追踪质膜蛋白动态（如内吞、胞吐）、膜微域研究。

2. 病原互作研究

   • 可视化病原体侵染过程中宿主膜结构变化（如真菌吸器形成）。

3. 转基因植物开发

   • 作为报告基因标记转化效率，或与目标蛋白融合研究亚细胞定位。

4. 药物筛选

   • 基于膜通透性变化的化合物高通量筛选模型。

5. 教学与科普

   • 直观演示植物细胞膜结构与功能，适用于生物学实验教学。

---

六、总结

pCAMBIA1300-35S-PM-mCherry凭借其精准定位、高灵敏荧光信号和广泛兼容性，成为植物膜生物学研究的核心工具。通过规范操作、严格防污染措施及科学的保藏策略，可最大化实验成功率，助力科研人员深入解析细胞膜动态机制。

　　智立中特（武汉）生物科技有限公司主要致力于质粒微生物资源的保护、共享和持续利用，围绕我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展等重大需求，探索、发现、收集国内外的微生物资源，妥善长期保存管理；在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供质粒载体物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。旗下质粒载体网zlzt.com是一款提供质粒载体展示及定制的专业型网站，由智立中特（武汉）生物科技有限公司联合多家企业公司科研院校共同打造！主要展示了各种基因类型下的质粒载体！

　　我们的工作主要包括：广泛分离、收集、保藏、交换和供应各类微生物质粒菌种；保存用于专利程序的各种可培养生物材料；质粒载体类保藏技术研究；微生物分离、培养技术研究；微生物鉴定和复核技术研究；保藏菌种的资料情报收集和提供及编辑微生物菌种目录。