微生物菌种保藏与复苏全攻略

🔬 冻干菌株复苏操作指南
复苏前的准备
准备所有实验用品，包括酒精灯、75%消毒酒精棉、移液枪、接种环、培养基和冻干菌种。确保所有操作在符合生物安全保护及无菌条件下进行。
开启冻干菌种
用75%酒精棉消毒西林瓶表面，然后在无菌条件下，按铝盖上的箭头方向打开塑料盖，撕开铝盖，打开西林瓶胶塞。
加入液体培养基
用移液枪向冻干质控菌种西林瓶加入0.3ml左右的配套液体培养基，水化冻干粉，将冻干质控菌种溶解成为均匀的悬液。
接种培养
用移液枪吸取适量冻干粉水化悬液，移至适合其生长的斜面、平板或液体培养基上。或者，用接种环蘸取适量冻干粉水化悬液，或平板划线接种（便于观察菌落形态）。接种完后，在器皿上标记菌种编号、传代数、日期等信息。倒置放进恒温培养箱培养。
培养与观察
将转接的斜面或平板以及西林瓶里剩余的菌悬液放置于36℃培养箱中进行培养。次日，观察菌种的生长情况，如未生长，应继续培养24H，或吸取西林瓶里的悬液再次接种斜面或平板培养基，培养24H观察。

🔬 冻干菌株复苏补充说明
不同菌种的水化液和培养基
志贺氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌等：水化液为脑心浸液培养基，培养基为营养琼脂，培养条件37±1℃培养24-48h。
粪链球菌、乙型溶血性链球菌：水化液为脑心浸液培养基，培养基为血平板，培养条件37±1℃培养24-48h。
VB0非01群霍乱弧菌：水化液为碱性蛋白胨水，培养基为碱性琼脂，培养条件37±1℃培养24-48h。
副溶血性弧菌、创伤弧菌：水化液为3%NaCl碱性蛋白胨水，充分悬浮后放置于37±1℃下复苏8-12小时；再转接培养基为3%NaCl营养琼脂，培养条件37±1℃培养24-48h。
单核细胞增生李斯特氏菌：水化液为脑心浸液培养基，培养基为血平板或胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA-YE），培养条件37±1℃培养24-48h。
生孢梭菌、产气荚膜梭菌：水化液为脑心浸液培养基，培养基为疱肉牛肉粒肉汤加液体石蜡1cm（隔绝空气营造厌氧环境），培养条件37±1℃培养24-48h。
空肠弯曲菌：水化液为布氏肉汤，培养基为血平板，培养条件42±1℃微需氧条件下培养48-72h。
两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌：水化液为TPY肉汤，培养基为BBL琼脂，培养条件42℃厌氧环境下培养48-72h。
德氏保加利亚乳杆菌：水化液为MSR肉汤，培养基为脱脂奶粉溶液（10%），培养条件37±1℃培养24-48h。
黑曲霉、桔青霉、绳状青霉、白色念珠菌、啤酒酵母：水化液为沙氏液体培养基，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），培养条件25-28℃培养2-5天。

🔬 菌株纯度检查与确认
菌落形态
观察单菌落在分离平板上的特征。
细胞形态
镜检观察细胞的形态。
芽胞大小、位置、性状
检查芽胞的大小、位置和性状。
生化鉴定
进行必要的生化鉴定，如有杂菌污染，需划线分纯。

🔬 菌种的保存
确定适宜的保藏方法
同一菌株应选用两种或以上方法进行保藏。
异地保存备份
重要菌种应异地保存备份。

🔬 菌种保存方法
传代培养法
复苏后的第一代放于4℃冰箱或室温保存，定期传代培养。保藏时间依微生物种类而定。
液体石蜡法
将无菌石蜡加在长菌的斜面或半固体上，高出斜面顶端1cm为准，隔绝空气，试管直立，置于低温或室温保存。
甘油冻存法
将复活后经过性能确认的菌株新鲜培养物（一般是第二代菌株），用0.85%的灭菌生理盐水（约1-2ml）洗斜面菌苔成菌悬液；将上述菌悬液吸取适量于灭菌管（冻存管）中（如，灭菌管容量为5ml，则取1.5ml菌液），加入等体积的40%灭菌甘油，混匀，密封。保藏温度为-20℃，一般可保存1-2年。
瓷珠保存管保存
菌株保藏管内含特制的小珠（20-25颗）和特殊溶液，只需将培养好的菌株接入溶液中，摇匀成菌悬液，细胞即吸附于小珠上，然后吸出溶液，将保藏管置-70℃可保存5年，置-20℃可保存2-3年。

🔬 菌种复苏与活化
复苏操作
挑取纯培养物。
上下颠倒混匀。
吸干液体。
超低温冷藏。
活化操作
置于肉汤活化。
或平板划线活化。
迅速挑取瓷珠。
放回低温冷藏。

🔬 菌种接收与登记
获得途径
购买、交换、接收赠送。
来源
专门的菌种保藏机构，如美国典型培养物保藏中心（ATCC）菌株或商业来源的ATCC演化菌株。
记录信息
记录菌株号、菌名、来源、数量、生产日期、接收日期等信息。