质粒及siRNA转染细胞操作技巧-实验干货

1.细胞铺板

通常在转染前一天进行细胞铺板，根据细胞生长速度计数后进行铺板，保证第二天转染时细胞密度达到80%~90%左右。

2.细胞转染

以lip2000作为转染试剂为例，在转染前更换细胞培养基（无双抗，无血清），用opti-mem稀释质粒或siRNA，另用opti-mem稀释lip2000，将两者配好静置2~3分钟后，混匀在同一个管内，混匀时避免粗暴用力吹打（因为有可能会导致脂质体失效），静置3~5min，将配好的转染溶液加到细胞培养板中，并轻轻晃匀。

备注：细胞转染时为什么需要用无血清培养基呢？是因为血清的存在会影响DNA-转染复合物的形成，在DNA-转染复合物形成时需用无血清培养基opti-mem来稀释质粒或者siRNA和助转染试剂。另外血清的存在会降低转染效率，对于绝大部分贴壁细胞系来说，建议在做质粒或siRNA转染细胞前将完全培养基更换为无血清培养基。

3.换液

助转染试剂（如lipo2000）具有一定细胞毒性，所以需要在质粒或siRNA转染细胞4~8h后及时换液（将无血清培养基更换为完全培养基）。

4.检测
在成功转染24~48小时后，将细胞从培养箱中取出，可进行后续相关检测。

1. 在转染时尽量避免有双抗的存在，因为转染试剂会增加细胞膜的通透性，此时抗生素（如青霉素与链霉素）会进入细胞，增加细胞毒性，影响实验结果。

2. 质粒转染4-8小时要进行换液，因为lip2000存在细胞培养体系中时间过长会产生较大毒性，影响细胞状态。

3. 分别用无血清培养基稀释转染试剂与质粒或siRNA后，混合后一定要静置，以保证转染复合物的形成。

4. 转染试剂加入量的确定需要实验人员自己进行摸索确定，因为转染试剂的说明书加入量为大概范围，要想获得最佳转染效果须进行预实验确定。

5. 在转染siRNA前，因为RNA 以膜或干粉状态附着于管壁，开盖之前务必瞬时离心，使用前加 RNase Free Water 溶解成 20μM 的储存液，分装后置于-20℃~-80℃保存，以利于后续实验，且避免反复冻融（最多 5 次）。