CCK8药物筛选实验方法及要点分享

一、背景介绍：

1)细胞学：细胞学是研究细胞的形态、结构和功能以及与细胞生长、分化、进化等相关联的生物学的一个分支学科。生物体的生理功能及一切生命现象，都是以细胞为基本单位而表达的。因此，不论对生物体的遗传、发育以及生理机能的了解，还是对于作为医疗基础的病理学、药理学等以及农业的育种等，细胞学都至关重要。

2)细胞功能学：细胞增殖与细胞凋亡、细胞周期等是肿瘤研究的重要表型，是分子生物学和药理学研究解决的问题之一。通过在细胞中过表达或干扰某个基因研究基因对细胞增殖能力的影响，进一步研究基因的功能，或对细胞进行药物处理，研究药物对增殖的影响。

3)实验类型：

a：通过MTT、CCK-8实验等检测细胞增殖情况；

b：通过Annexin V/PI双染实验等检测细胞凋亡情况；

c：通过Flow cytometer 检测细胞周期的阻滞情况；

d：通过Western blot和qPCR等检测细胞的蛋白基因表达水平。

二、细胞功能学实验方法和技巧

近期，本公司与知名药企签订了大量的药物筛选CCK-8检测实验，且与高校和研究所合作，承接了大量的细胞功能学实验，推动我们在该领域又获得了进一步的经验技术积累。众所周知，细胞功能学实验种类较多，今天我们重点和大家讲述CCK-8实验，对该实验的细节和要点进行梳理，与大家一起共同学习，共同进步！

1)CCK-8实验检测细胞增殖

在具体介绍CCK-8实验之前，我们先来看一下CCK-8实验的优点。

在CCK-8实验中，产生的甲瓒产物是水溶性的，无需换液，悬浮和贴壁细胞均适用；同时不需要放射性同位素和有机溶剂，对细胞的毒性小；CCK-8细胞活性检测试剂毋需预制，即开即用，且灵敏度高，线性范围宽，数据可靠，重现性好，操作简便，省时省力。其也适用于高通量药物筛选。

与此同时，抗药物的筛选体系复杂，涉及到宏观到微观水平的一系列实验，药物筛选是新药研发过程中重要的阶段之一，因此选择合适的药筛模型可以在最短时间得到很高的效率；细胞平台就是药物筛选使用最多的一个方面，目前我们可以分离培养小鼠、大鼠和人（正常和病变）的原代细胞，同时我们可以根据您的需求，为您提供个性化的原代细胞定制服务（原代细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。

通过CCK-8实验，采用培养的细胞模型，给出待测药物的IC50值、最低有效浓度以及相关结果分析报告。

a实验原理：

在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐），可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan），其颜色的深浅与细胞增殖成正比，与细胞毒性成反比，对同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，可以间接反映活细胞的数量。

b实验步骤：

(1)种板数：确定每孔所用的细胞数目；该细胞数需要根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素确定最佳的种板浓度。

(2)种板：以96孔板为例，96孔板横向是1-12的数字，纵向是A-H，可做多个实验组，每组设置4-6个复孔，同时设置空白组，最边缘孔加入PBS缓冲液减少蒸发带来的影响。种板后，将细胞置于37℃ 、5%CO₂细胞培养箱中培养12-24 h，使细胞达到指数期。

(3)加药及加药后孵育时间：观察细胞贴壁状态，吸出各孔培养基，实验组加入含不同浓度药物的培养基，空白组加入不含药物培养基，然后将96孔板在37℃、 5% CO₂的细胞培养箱中孵育适当时间，根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间。

(4)加入CCK-8：两种方法，每孔直接加入10ul的CCK-8溶液,或者配置成含10% CCK-8溶液的培养基以换液的形式加入，注意加入过程中避免产生气泡，气泡会影响吸光度的检测，可以将枪头浸入培养液中缓慢加入。

(5)加入CCK-8后孵育时间：将加完CCK-8的培养板放入37°C、 5%CO₂ 培养箱中孵育1-4h，CCK-8试剂加入后孵育时间也需要自己摸索，随着时间的增加，OD值就会增大。可以在0.5h、1.0h、2.0h分别测OD值，把OD值控制在1.0左右。

(6)测OD值：将96孔板取出，酶标仪检测各孔在450nm波长处的OD值，分析处理数据，绘制增殖曲线。

c 案例展示：

目前，我们进行了大量的CCK-8实验，以乳腺癌细胞MDA-MB-231为例。前期，对两种细胞进行多次传代培养，充分了解细胞的生长状态，确定了细胞的种板密度（10000/孔）。将细胞种植到96孔板后继续培养24h，细胞状态如图。根据项目要求，设计了8个药物浓度梯度作为实验组，1个空白组，1个调零组，药物处理后继续孵育24h。加入CCK-8试剂，2h后用酶标仪检测OD值。结果如表所示，该结果表明药物抑制了MDA-MB-231细胞的增殖，其IC50值为13.04 μg/mL。

2)Annexin V/PI双染实验检测细胞凋亡

结果展示：

3)Flow cytometer 检测细胞周期的阻滞

结果展示：

4)Western blot和qPCR等检测细胞的蛋白基因表达水平

结果展示：

5) 其他产品服务

上述实验重点阐述了CCK8药物筛选实验方法及要点，简明扼要的阐述了几种细胞功能学实验，供大家参考。同时本公司可承接各类细胞相关实验，如细胞焦亡相关探究、细胞凋亡机制检测、流式细胞仪检测细胞内活性氧/线粒体膜电位、各类细胞染色相关实验等。

三、宗旨理念

a. 实验过程及结果承诺客观真实，原始数据全部反馈给客户。

b. 实验过程全部有据可循，拍照留存，实验数据保证真实有效。