RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验原理及应用解析

一、背景介绍

        95%的人类基因组并不编码基因，而是产生大量的非编码RNA,真正编码蛋白质的基因只占人类总基因组的约2% 。这些非编码RNA在生命的生长发育的各个阶段都发挥着重要的调节作用，与艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多种病变密切相关，并且参与着干细胞和表观遗传学调控。而RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控，包括剪接（splicing）、出核转运（nuclear export）、mRNA 稳定性以及蛋白转译过程，因此，对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化。因此，RNA研究也被越来越多的科学家重视起来，目前已经成为生命科学研究中一个炙手可热的领域，而RIP技术也逐渐成为RNA研究领域的一项常规方法，帮助我们了解越来越受关注的转录后调控网络。

1.概述：
    RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 结合蛋白免疫沉淀）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行qPCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同，如：RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等。

2.技术应用：

可用于研究细胞内RNA与蛋白结合情况；

可用于发现RBP与非编码RNA（LncRNA、miRNA等）的相互作用；

可用于绘制全基因组范围的RNA与RBP相互作用图谱。

1.实验步骤：

2.实验流程：

 

3.案例展示：
       以一篇发表在“Nucleic Acids Res”期刊的题为“Foxo3 circular RNA retards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2”的研究为例(DOI: 10.1093/nar/gkw027)。该研究主要是circ-Foxo3通过与蛋白p21和CDK2结合调控细胞周期。通过cyclin A等蛋白的抗体去做RIP，然后通过PCR来检测circ-Foxo3，结果如下图：