GST pull-down实验原理及应用解析

            GST，全称为glutathione-S-transferase，即为谷胱甘肽-S-转移酶蛋白，可以与谷胱甘肽（glutathione，GSH）结合，其与CoIP实验都是验证蛋白互作的有效方法。今天就简单介绍下GST pull-down实验，希望能让做相关实验的小伙伴对此有更深入的理解。

   其实验原理为：首先利用重组技术将诱饵蛋白A与GST进行融合，然后将GSH固定于琼脂糖珠，形成GSH-琼脂糖珠，进而将融合蛋白（A-GST）结合到固定化的GSH载体上，此时，当环境中存在与蛋白A相互作用的蛋白B时，就会被吸附，形成琼脂糖珠-GSH-GST-A-B结构的复合物，与A蛋白互作的蛋白B即可被吸附分离，用于后续检测。

二、应用
GST pull-down是体外检测蛋白之间相互作用行之有效的实验方法，可用于验证两种已知蛋白可能存在的直接互作关系（GST pull-down+Western blot）；另外，还可以用于寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白（GST pull-down+LC-MS）。

三、实验流程
GST-A融合蛋白的表达
1. 将目的蛋白与GST重组的质粒转入 BL21菌株中；
2. 挑单克隆于4ml LB(加入4uLAmp⁺)培养基中，37℃摇菌过夜；
3. 将菌液转移至500ml LB培养基中（加入500ul Amp⁺），37℃，180rpm摇菌培养；
4. 测定OD值，当OD值在0.6左右时，加入IPTG，在20℃摇菌培养数小时；
5. 收菌，将菌液分装至50ml离心管 ，于4℃ 条件下，5000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，如暂时不用，可存放于-80℃中；
6. 加入 5ml PBS/管，重悬后离心5min，弃上清；
7. 加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中；
8. 冰浴条件下超声破碎，4℃离心， 12000rpm，10min，取上清；
GST-A融合蛋白的纯化

1. 在裂解液上清中加入适量体积50%谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B，4℃摇床上缓慢摇动30~60min;
2. 4℃，4000rpm离心5min，弃去上清；
3. 加入200ul预冷的PBS溶液，轻晃悬浮珠子，洗涤一次，4℃，4000rpm离心5min，弃去上清，重复此步骤3次；
4. 吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合GST-A的琼脂糖凝胶。

GST-Pull Down实验

1. 获取His标签融合表达的蛋白
2. 混合含有A-GST蛋白和含有其他蛋白的溶液，将混合物在4°C旋转混匀孵育过夜;
3. 4℃，4000rpm离心5min，弃去上清液后，用预冷缓冲液进行洗涤，重复三次；
4. 吸干琼脂糖凝胶上方的水层后，加入1×蛋白电泳上样缓冲液，将蛋白样本煮好后，分装冻存于-80℃冰箱，用于后续检测

四、案例分析

以发表在《Theranostics》期刊（IF:11.556，JCR分区：Q1）上的一篇名为“Lgr5-mediated p53 Repression through PDCD5 leads to doxorubicin resistance in Hepatocellular Carcinoma”的文章为例，作者鉴定程序性细胞死亡蛋白（PDCD5）是Lgr5的靶基因，进而为了研究PDCD5是否直接与Lgr5结合，在大肠杆菌系统中用Lgr5和PDCD5进行了GST pull-down测定，首先通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析鉴定了纯化的蛋白质（Fig.4-F）。

通过GST pull-down的进一步分析表明，Lgr5的N端细胞外结构域可以直接与PDCD5结合（Fig.4G）。

五、我们的优势
1. 合理设置对照，排除干扰因素
2. 实验结果如实呈现，所有数据有迹可循