胰蛋白酶（Trypsin）活性检测试剂盒说明书（微量法）

胰蛋白酶（Trypsin）活性检测试剂盒说明书（微量法）
注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。                              微信 13321108309
规格：100管/96样
产品说明：
胰蛋白酶选择性水解变性蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，是一种重要的消化酶。此外，胰蛋白酶还广泛应用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产生的
局部水肿、血肿及脓肿等的辅助治疗。
胰蛋白酶催化水解BAEE的酯键，生成 BA，BA在 253nm处有吸收峰，通过测定253nm 吸光度增加速率，即可计算出胰蛋白酶的活性。
自备仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
产品内容：  
提取液：液体100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加0.5mL 蒸馏水充分溶解。
试剂二：液体20mL×1 瓶，4℃保存。
操作步骤：  

• 粗酶液提取：

称取约0.1g样品，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，10000rpm 4℃离心10min，取上清液，即粗酶液，置冰上待测。或者直接称取1mg酶粉，加入1mL提取液，充分混匀后置冰上待测。（为保证实验的准确性建议梯度稀释）。
二、测定：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到253 nm，蒸馏水调零。
2. 工作液的配置：将试剂一与试剂二按2:97配置工作液，按需配置，置于 37℃水浴预热30min以上。
3.  空白管：取微量石英比色皿/96 孔板，加入198μL工作液，再加入2μL蒸馏水，迅速于 253nm 测定 0s 和60s的吸光度，分别记为 A1 和 A2，△A 空白= A2-A1。
4.  测定管：取微量石英比色皿/96 孔板，加入198μL工作液，再加入2μL粗酶液，迅速于 253nm 测定0s和60s的吸光度，分别记为 A3和A4，△A 测定= A4-A3。
三、胰蛋白酶活性计算公式：
（1）按蛋白浓度计算


活性单位定义：在1mL体系下，37℃每毫克蛋白质每分钟催化253nm处吸光值增加0.001为1个酶活单位。
胰蛋白酶（U/mg prot）= (△A 测定-△A 空白)÷0.001÷（Cpr×V1）÷T×（V3÷V4）
=100000×(△A 测定-△A 空白) ÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
活性单位定义：在1mL体系下，37℃每克组织每分钟催化253nm处吸光值增加0.001为1个酶活单位。
胰蛋白酶（U/g鲜重）= (△A 测定-△A 空白) ÷0.001÷（W×V1÷V2）÷T×（V3÷V4）
=100000×(△A 测定-△A 空白) ÷W
Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：组织质量（g）； V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），10μL=0.01 mL； V2：粗酶液总体积（mL），1 mL； T：反应时间（min），1min； V3：反应总体积，198μL+2μL=200μL=0.2mL； V4：1mL体积。
注意事项：
1、实验前用1~2个样做预实验，保证吸光值变化在 0.01～0.15之间。
2、配制好的试剂二4℃保存，7天内使用完毕。

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