锰过氧化物酶（Manganese peroxidase，Mnp）试剂盒说明书 
微量法
注意：正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定。
微信 13321108309
规格：100T/48S
产品内容：
试剂一：液体110mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体2mL×1 支，4℃保存。
试剂三：液体4mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体2mL×1 支，4℃保存。
产品说明：
锰过氧化物酶（EC1.11.1.13）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，主要存在于担子菌中，属于木质素降解酶系，能有效的降解木质素及废水和土壤中比较难降解的氯化物，叠氮化合物、DTT，多环芳烃等。锰过氧化物酶在Mn²⁺存在的条件下，将愈创木酚氧化为四邻甲氧基连酚，在465nm 有特征吸收峰。
试验中所需的仪器和试剂：
天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
1. 组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g，加入1mL 试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000g 离心10min，取上清置于冰上待测。
2. 细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3 秒，间隔7 秒，总时间3min）；然后4℃，10000g 离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 培养液或其它液体：直接检测。
二、测定操作
1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至465nm，蒸馏水调零。
2、测定前将试剂一、二、三、四在37 度（哺乳动物）或25 度（其它动物）放置10min 以上。
3、样本测定表

试剂名称（μL）	测定管
样品（μL）	20
试剂一（μL）	100
试剂二（μL）	20
试剂三（μL）	40
试剂四（μL）	20

在微量石英比色皿或96 孔板中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录465nm 下30s 时的吸光值A1和2min30s后的吸光值A2。计算△A=A2-A1。
注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三、四按比例配成混合液，在37度（哺乳动物）或25度（其它物种）放置10min以上，测定时加入20μL样本和180μL混合液测定。
三、酶活计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性（nmol/min/mg prot）=[△A×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（V 样×Cpr）÷T
= 413×△ A÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
3．MnP 活性（nmol/min/g）=[△A×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（V 样×W÷V样总）÷T
= 413×△ A÷W
酶活性定义：每10⁴ 个细胞每分钟氧化1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性（nmol/min /10⁴ cell）=[△A×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T
=413×△ A÷细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每升培养液每分钟氧化1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性（nmol/min /L）=[△A×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V ÷T= 413×△ A
ε：愈创木酚摩尔消光系数：12100L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，2×10^-4 L；V 样：反应中样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min。
b. 用96 孔板测定的计算公式如下
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T
=826×ΔA÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性（nmol/min/g 鲜重）= [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹] ÷（V样×W÷V 样总）÷T
= 826×ΔA÷W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每10⁴ 个细胞每分钟氧化1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹] ÷（V样×细胞数量÷V 样总）÷T
= 826×ΔA÷细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升培养液每分钟氧化1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP 活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T= 826×ΔA
ε：愈创木酚摩尔消光系数：12100L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 反总：反应总体积，2×10^-4L；V 样：反应中样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min。