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技术资料/正文
量子点偶联抗体方法
629 人阅读发布时间：2024-07-08 15:01
简介
量子点作为荧光探针使用时，其表面需要修饰抗体、多肽、糖类等生物分子。如何将生物分子有效的偶联在量子点表面并保持其生物活性，是量子点生物学应用中十分重要的一步。量子点偶联抗体的方法主要分为非共价偶联方法和共价偶联方法。
非共价结合
（1）亲和素系统
生物素-亲和素系统（Biotin-avidin system，BAS）以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，结合二者即可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质。亲和素与生物素间的亲和力极强，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多层放大效应。生物素标记抗体和酶的标记率高，又不影响蛋白的活性。基于生物素-亲和素的非共价结合反应也应用于量子点抗体偶联中，抗体在偶联反应前需要先生物素化。该系统条件下进行的偶联没有位点特异性，是亲和素化的量子点与整个抗体分子之间进行的非共价结合。
（2）双功能衔接器/蛋白A系统
抗体和量子点通过双功能衔接器或者蛋白A为媒介进行偶联。
①双功能衔接器偶联原理
基于静电吸引作用。衔接器蛋白同时具有亮氨酸拉链结构域和G蛋白结构域，其中亮氨酸拉链结构域带有正电荷，可以与量子点（CdSe/ZnS）静电结合，G蛋白结构域则可结合抗体的Fe区域。应用该种“双功能”衔接器进行偶联时，抗体的Fe末端和量子点表面接合，其抗原结合靶点F（ab'）2结构域则朝外。组氨酸标签的肽和抗体可以使用镍-氨三乙酸（Ni-NTA）结构作为双功能衔接器用于量子点偶联。在该反应中，氨三乙酸基团通过共价作用和量子点表面结合，镍离子与组氨酸标签的抗体则通过螯合作用结合。同生物素-亲和素结合相比较，这种组氨酸标签的方法有诸多优点：可以控制配体结合的方向（组氨酸标签可以很方便结合于蛋白或肽的特定位点）、探针尺寸紧凑，生产成本较低。
②蛋白A系统
蛋白A是在葡萄球菌细胞壁上发现的一种表面蛋白，该蛋白可以通过与Fe片段的相互作用结合于免疫球蛋白表面。蛋白A与谷胱甘肽包被量子点表面的羧基进行反应，抗体再与蛋白A结合。各种不同类型的抗体通过该种非共价偶联的方式很容易的结合在量子点表面。
共价结合
（1）氨基和羧基共价结合
常用的共价结合方法是使用零长度交联剂乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物
（EDC）将抗体和量子点直接偶联在一起。在该反应中，先用N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）将量子点表面的羧基活化，在EDC的作用下，活化的羧基和抗体表面的原始氨基形成酰胺键。氨基和羧基共价结合反应的优点在于大部分蛋白都包含有原始的氨基和羧基，在进行量子点偶联之前不需要进行化学修饰；但是在该偶联反应中存在一种可能，即抗原的抗体结合位点被结合在抗体F片段附近的氨基酸非特异性封闭。因此，EDC介导的抗体与量子点的偶联反应可能会导致较低的量子产量和偶联产物的聚集。
（2）氨基和巯基共价结合
为了避免抗体结合位点的非特异性吸附，琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物（SMCC）偶联反应被用于抗体和量子点的偶联。在SMCC的偶联反应中，二硫苏糖醇（DTT）活化抗体产生巯基（Fe片段），巯基和QDs-SMCC表面的顺丁烯二酰亚胺基结合。在该方法中，二硫键结合在两个重链组成的铰链区，能够选择性的粘附以构建两个抗体片段，每个片段都包含有自由的巯基和一个抗原结合位点。在氨基和巯基的共价反应中，通过将PEG偶联于量子点表面可以改善其稳定性和水溶性。氨基酸结尾的PEG500通过EDC和量子点（CdSe/ZnS）偶联，接着两个长链的双功能交联剂sulfo-LC-SPDP，sulfo-SMCC分别活化抗体和量子点，进行氨基和巯基的共价反应偶联抗体和量子点。
（3）醛基和酰肼共价结合
氧化作用将抗体Fe片段的碳水基团活化为醛基，醛基可以与量子点共价结合。很多免疫球蛋白分子是糖蛋白，可以通过高碘酸盐氧化构建醛基。多克隆IgG分子Fe片段有糖基，该基团可以完全从抗原结合位点移出，通过糖链进行偶联反应。这时高碘酸盐氧化的抗体可以与酰肼基团反应。羧基化的量子点可以通过ADH修饰以在表面产生酰肼，酰肼进而和氧化的抗体通过醛基-酰肼的共价化学反应偶联。由于抗体表面碳水化合物位点是已知的，该方法可以控制量子点-抗体结合的比率。
量子点作为荧光探针使用时，其表面需要修饰抗体、多肽、糖类等生物分子。如何将生物分子有效的偶联在量子点表面并保持其生物活性，是量子点生物学应用中十分重要的一步。量子点偶联抗体的方法主要分为非共价偶联方法和共价偶联方法。
非共价结合
（1）亲和素系统
生物素-亲和素系统（Biotin-avidin system，BAS）以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，结合二者即可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质。亲和素与生物素间的亲和力极强，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多层放大效应。生物素标记抗体和酶的标记率高，又不影响蛋白的活性。基于生物素-亲和素的非共价结合反应也应用于量子点抗体偶联中，抗体在偶联反应前需要先生物素化。该系统条件下进行的偶联没有位点特异性，是亲和素化的量子点与整个抗体分子之间进行的非共价结合。
（2）双功能衔接器/蛋白A系统
抗体和量子点通过双功能衔接器或者蛋白A为媒介进行偶联。
①双功能衔接器偶联原理
基于静电吸引作用。衔接器蛋白同时具有亮氨酸拉链结构域和G蛋白结构域，其中亮氨酸拉链结构域带有正电荷，可以与量子点（CdSe/ZnS）静电结合，G蛋白结构域则可结合抗体的Fe区域。应用该种“双功能”衔接器进行偶联时，抗体的Fe末端和量子点表面接合，其抗原结合靶点F（ab'）2结构域则朝外。组氨酸标签的肽和抗体可以使用镍-氨三乙酸（Ni-NTA）结构作为双功能衔接器用于量子点偶联。在该反应中，氨三乙酸基团通过共价作用和量子点表面结合，镍离子与组氨酸标签的抗体则通过螯合作用结合。同生物素-亲和素结合相比较，这种组氨酸标签的方法有诸多优点：可以控制配体结合的方向（组氨酸标签可以很方便结合于蛋白或肽的特定位点）、探针尺寸紧凑，生产成本较低。
②蛋白A系统
蛋白A是在葡萄球菌细胞壁上发现的一种表面蛋白，该蛋白可以通过与Fe片段的相互作用结合于免疫球蛋白表面。蛋白A与谷胱甘肽包被量子点表面的羧基进行反应，抗体再与蛋白A结合。各种不同类型的抗体通过该种非共价偶联的方式很容易的结合在量子点表面。
共价结合
（1）氨基和羧基共价结合
常用的共价结合方法是使用零长度交联剂乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物
（EDC）将抗体和量子点直接偶联在一起。在该反应中，先用N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）将量子点表面的羧基活化，在EDC的作用下，活化的羧基和抗体表面的原始氨基形成酰胺键。氨基和羧基共价结合反应的优点在于大部分蛋白都包含有原始的氨基和羧基，在进行量子点偶联之前不需要进行化学修饰；但是在该偶联反应中存在一种可能，即抗原的抗体结合位点被结合在抗体F片段附近的氨基酸非特异性封闭。因此，EDC介导的抗体与量子点的偶联反应可能会导致较低的量子产量和偶联产物的聚集。
（2）氨基和巯基共价结合
为了避免抗体结合位点的非特异性吸附，琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物（SMCC）偶联反应被用于抗体和量子点的偶联。在SMCC的偶联反应中，二硫苏糖醇（DTT）活化抗体产生巯基（Fe片段），巯基和QDs-SMCC表面的顺丁烯二酰亚胺基结合。在该方法中，二硫键结合在两个重链组成的铰链区，能够选择性的粘附以构建两个抗体片段，每个片段都包含有自由的巯基和一个抗原结合位点。在氨基和巯基的共价反应中，通过将PEG偶联于量子点表面可以改善其稳定性和水溶性。氨基酸结尾的PEG500通过EDC和量子点（CdSe/ZnS）偶联，接着两个长链的双功能交联剂sulfo-LC-SPDP，sulfo-SMCC分别活化抗体和量子点，进行氨基和巯基的共价反应偶联抗体和量子点。
（3）醛基和酰肼共价结合
氧化作用将抗体Fe片段的碳水基团活化为醛基，醛基可以与量子点共价结合。很多免疫球蛋白分子是糖蛋白，可以通过高碘酸盐氧化构建醛基。多克隆IgG分子Fe片段有糖基，该基团可以完全从抗原结合位点移出，通过糖链进行偶联反应。这时高碘酸盐氧化的抗体可以与酰肼基团反应。羧基化的量子点可以通过ADH修饰以在表面产生酰肼，酰肼进而和氧化的抗体通过醛基-酰肼的共价化学反应偶联。由于抗体表面碳水化合物位点是已知的，该方法可以控制量子点-抗体结合的比率。