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技术资料/正文
细胞培养杂谈
769 人阅读发布时间：2022-02-25 14:21
小编上回讲到「波诡云谲」的血清江湖，本回跟大家聊聊细胞培养的那些事儿！！
*注意：满满都是细节！！！
何为细胞培养？
细胞培养是指，将细胞从动物或植物体内取出，然后在适宜的人工环境中生长的过程。
细胞可以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械方法进行解离，也可以来源于已建立的细胞系或细胞株。按照细胞来源不同，可大致将细胞分为以下几种：
1、原代培养
原代培养是指细胞从组织中分离出来后，在适宜条件下增殖，直到它们占据所有可用的基质（即达到汇合状态）的培养阶段。在此阶段，必须通过将细胞转移到含有新鲜生长培养基的新容器中进行继代培养（即传代），以为其提供更多的继续生长空间。
2、细胞系
第一次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。来自于原代培养的细胞系寿命有限（即：有限细胞系），随着细胞的传代，生长能力最强的细胞会占据优势，最终导致细胞群体在基因型和表型上达到一定程度的均一性。
3、细胞株
如果通过克隆或其他方法从培养物中阳性筛选出了细胞系的亚群，则该细胞系成为一个细胞株。与亲代细胞系起始时相比，细胞株通常会获得一些其他的遗传学改变。
4、有限细胞系与连续细胞系
正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后就会丧失增殖能力，这是一种由遗传决定的事件，称之为衰老；此类细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞系可以通过被称为转化的过程而变为永生化细胞系，该过程可以自发发生，也可以通过化学或病毒诱导而发生。当一个有限的细胞系经历转化并获得无限分裂的能力时，它就成为了一个连续细胞系。
培养条件
各种细胞的培养条件相差很大，但是培养细胞的人工环境必须包括合适的容器，其中含有一定的基质或培养基，为细胞提供必需的营养物质（氨基酸、碳水化合物、维 生素、矿物质）、生长因子、激素和气体（O2、CO2 ），并调节生理化学环境（pH、渗透压、温度）。大多数细胞为贴壁依赖性细胞，必须附着于固体或半固体基质上培养（贴壁培养或 单层培养），而另一些细胞则可在培养基中漂浮生长（悬浮培养）。
如何开展细胞培养
1.准备工作：
了解细胞特性
在细胞培养之前，我们要从细胞的产品说明书或者从 ATCC 细胞库查询了解所要养细胞的基本特性。建议分裂或传代的比例等信息。
准备培养基
根据培养细胞的特性，提前准备好适合的培养基和血清等。同时，充分了解到细胞的生长特性和形态特征，便于后续的培养观察。
2.贴壁细胞传代：
1）移弃使用过的细胞培养液。（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染）
2）使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液。（洗去残留的血清，避免影响胰酶的活性。）
3）以 25 cm2 的培养瓶（T25）为例，向瓶内加入 1 ml 胰蛋白酶-EDTA（请根据各细胞的指引使用合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，放到 37 ℃ 孵育。通常，1～2 分钟内，会发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流下，此时应加入 2-3 ml 含血清的完全培养液终止消化（细胞解离所需时间请参考各细胞的指引，并建议每隔 30 秒在显微镜下观察细胞的解离情况）。
4）使培养瓶倾斜，吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面，重复该动作 2-3 次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应避免气泡的产生）。
5）把所有的细胞悬液转移到 10 ml 离心管中，800-1000rpm 离心 3～5 分钟后移弃上清。
6）加入新的含血清完全培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新的含血清完全培养液至 8～10 ml，轻轻摇晃混匀。
7）放到 37 ℃ 培养箱中孵育，第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况（培养条件通常为 37℃，CO2 浓度为 5%，具体条件根据不同细胞而定）。
3.悬浮细胞传代：
因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。
1）离心传代，将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800-1000rpm 离心 3-5 分钟，移弃上清后，加入新鲜的含血清完全培养液重悬。按各细胞推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新鲜的含血清完全培养液至 8～10 ml，轻轻摇晃混匀。
2）放到 37 ℃ 培养箱中孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况（培养条件通常为 37℃，CO2 浓度为 5%，具体条件根据不同细胞而定）。
4. 细胞冻存：
1）按照「细胞传代步骤」中的方法收集细胞。
2）加入细胞冻存液（一般 10%DMSO+对应细胞的完全培养液），使细胞的终密度为 (5～10)×105 个/ml，移入细胞冻存管中。
3）程序降温（以使用需异丙醇的程序降温盒为例）：4℃ 30 min→-80℃ 过夜→液氮。（一定不能省略 4℃ 的 30 min，否则冻存液无法渗透到细胞，易产生冰晶导致细胞受损。）
5. 细胞复苏：
1）提前取出所需的含血清的完全培养基平衡至室温。取出贮存的细胞，待液氮挥发后，马上 37℃ 水浴中轻轻摇动使快速融化（通常 2 min 内，时间长了细胞状态会受影响）。为避免剧烈的温差变化导致冻存管炸裂，操作该步时请配戴防护面罩或防护目镜。
2）转移到无菌操作台，75% 酒精擦拭冻存管外部。
3）将细胞悬液转移到装有 5 ml 上述含血清完全培养液离心管中，800-1000rpm 离心 3-5 分钟，移弃上清。
4）重新加入上述含血清完全培养液重悬细胞，以约 (3～5)×105 个/ml 密度接种到培养器皿中。
5）放到 37℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况（培养条件通常为 37℃，CO2 浓度为 5%，具体条件根据不同细胞而定）。
细胞培养虽基础，但其蕴含的内容与经验却是丰富多彩，以上仅为小编经验之谈，各位大侠若有高见，咱们可以江湖切磋！！！！
公司：北京天悦生科技有限公司
地址：北京市顺义区通顺路308-8,205室
电话：010-64451773
网址：http://www.sunnysera.cn/
邮箱：info@sunnyscience.cn
*注意：满满都是细节！！！
何为细胞培养？
细胞培养是指，将细胞从动物或植物体内取出，然后在适宜的人工环境中生长的过程。
细胞可以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械方法进行解离，也可以来源于已建立的细胞系或细胞株。按照细胞来源不同，可大致将细胞分为以下几种：
1、原代培养
原代培养是指细胞从组织中分离出来后，在适宜条件下增殖，直到它们占据所有可用的基质（即达到汇合状态）的培养阶段。在此阶段，必须通过将细胞转移到含有新鲜生长培养基的新容器中进行继代培养（即传代），以为其提供更多的继续生长空间。
2、细胞系
第一次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。来自于原代培养的细胞系寿命有限（即：有限细胞系），随着细胞的传代，生长能力最强的细胞会占据优势，最终导致细胞群体在基因型和表型上达到一定程度的均一性。
3、细胞株
如果通过克隆或其他方法从培养物中阳性筛选出了细胞系的亚群，则该细胞系成为一个细胞株。与亲代细胞系起始时相比，细胞株通常会获得一些其他的遗传学改变。
4、有限细胞系与连续细胞系
正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后就会丧失增殖能力，这是一种由遗传决定的事件，称之为衰老；此类细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞系可以通过被称为转化的过程而变为永生化细胞系，该过程可以自发发生，也可以通过化学或病毒诱导而发生。当一个有限的细胞系经历转化并获得无限分裂的能力时，它就成为了一个连续细胞系。
培养条件
各种细胞的培养条件相差很大，但是培养细胞的人工环境必须包括合适的容器，其中含有一定的基质或培养基，为细胞提供必需的营养物质（氨基酸、碳水化合物、维 生素、矿物质）、生长因子、激素和气体（O2、CO2 ），并调节生理化学环境（pH、渗透压、温度）。大多数细胞为贴壁依赖性细胞，必须附着于固体或半固体基质上培养（贴壁培养或 单层培养），而另一些细胞则可在培养基中漂浮生长（悬浮培养）。
如何开展细胞培养
1.准备工作：
了解细胞特性
在细胞培养之前，我们要从细胞的产品说明书或者从 ATCC 细胞库查询了解所要养细胞的基本特性。建议分裂或传代的比例等信息。
准备培养基
根据培养细胞的特性，提前准备好适合的培养基和血清等。同时，充分了解到细胞的生长特性和形态特征，便于后续的培养观察。
2.贴壁细胞传代：
1）移弃使用过的细胞培养液。（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染）
2）使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液。（洗去残留的血清，避免影响胰酶的活性。）
3）以 25 cm2 的培养瓶（T25）为例，向瓶内加入 1 ml 胰蛋白酶-EDTA（请根据各细胞的指引使用合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，放到 37 ℃ 孵育。通常，1～2 分钟内，会发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流下，此时应加入 2-3 ml 含血清的完全培养液终止消化（细胞解离所需时间请参考各细胞的指引，并建议每隔 30 秒在显微镜下观察细胞的解离情况）。
4）使培养瓶倾斜，吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面，重复该动作 2-3 次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应避免气泡的产生）。
5）把所有的细胞悬液转移到 10 ml 离心管中，800-1000rpm 离心 3～5 分钟后移弃上清。
6）加入新的含血清完全培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新的含血清完全培养液至 8～10 ml，轻轻摇晃混匀。
7）放到 37 ℃ 培养箱中孵育，第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况（培养条件通常为 37℃，CO2 浓度为 5%，具体条件根据不同细胞而定）。
3.悬浮细胞传代：
因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。
1）离心传代，将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800-1000rpm 离心 3-5 分钟，移弃上清后，加入新鲜的含血清完全培养液重悬。按各细胞推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新鲜的含血清完全培养液至 8～10 ml，轻轻摇晃混匀。
2）放到 37 ℃ 培养箱中孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况（培养条件通常为 37℃，CO2 浓度为 5%，具体条件根据不同细胞而定）。
4. 细胞冻存：
1）按照「细胞传代步骤」中的方法收集细胞。
2）加入细胞冻存液（一般 10%DMSO+对应细胞的完全培养液），使细胞的终密度为 (5～10)×105 个/ml，移入细胞冻存管中。
3）程序降温（以使用需异丙醇的程序降温盒为例）：4℃ 30 min→-80℃ 过夜→液氮。（一定不能省略 4℃ 的 30 min，否则冻存液无法渗透到细胞，易产生冰晶导致细胞受损。）
5. 细胞复苏：
1）提前取出所需的含血清的完全培养基平衡至室温。取出贮存的细胞，待液氮挥发后，马上 37℃ 水浴中轻轻摇动使快速融化（通常 2 min 内，时间长了细胞状态会受影响）。为避免剧烈的温差变化导致冻存管炸裂，操作该步时请配戴防护面罩或防护目镜。
2）转移到无菌操作台，75% 酒精擦拭冻存管外部。
3）将细胞悬液转移到装有 5 ml 上述含血清完全培养液离心管中，800-1000rpm 离心 3-5 分钟，移弃上清。
4）重新加入上述含血清完全培养液重悬细胞，以约 (3～5)×105 个/ml 密度接种到培养器皿中。
5）放到 37℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况（培养条件通常为 37℃，CO2 浓度为 5%，具体条件根据不同细胞而定）。
细胞培养虽基础，但其蕴含的内容与经验却是丰富多彩，以上仅为小编经验之谈，各位大侠若有高见，咱们可以江湖切磋！！！！
公司：北京天悦生科技有限公司
地址：北京市顺义区通顺路308-8,205室
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