- 移动端
北京天悦生科技有限公司
7 年
手机商铺
商家活跃：
产品热度：
- NaN
- 0
- 0
- 0
- 0
推荐产品
技术资料/正文
细胞培养常见问题详谈
642 人阅读发布时间：2022-04-02 10:11
咱们书接上回，上文谈到细胞培养的操作，虽说满满都是细节，但在培养过程中还是会出现一些状况，今天咱们就细胞培养过程中常见的一些问题详细聊聊！！
一、细胞污染
1. 细菌污染
细菌污染是细胞培养中最常见的污染，细菌在显微镜下呈黑色细沙状（如下图），典型特征是，可以使培养基在短时间内变成黄色或白色浑浊。细胞形态会出现多角，多核状况；贴壁细胞不附着，停止生长甚至死亡。
污染处理：杆菌可选用 100ug/ml 庆大霉素处理一周，颗粒状细菌可用 25ug/ml 环丙沙星处理一周，效果相对还不错。如果污染严重或有富余细胞种子，建议立即做丢弃处理，并对培养器材和细胞房环境进行全面消毒。
2. 真菌污染
细胞培养中最常见的污染真菌有：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。
污染处理：可用 100ug 两性霉素 B/T25 瓶，处理一周。
注：两性霉素毒性较大，需要在细胞有 50% 以上且状态没受大影响前处理。
3. 支原体污染
支原体是隐蔽的污染物，不能通过过滤去除。显微镜下没有任何可见的支原体污染迹象，比如细胞病变和浊度或 pH 值变化（即使在严重污染的培养基中），这样就会导致我们产生错误的安全感。而在牛血清中，支原体是最常见的微生物之一（本公司胎牛血清 Cellsera 采用 3 次 0.1μm 无菌过滤，成品经无菌及支原体检测合格，保证产品质量）。
支原体的预防与清除：由于支原体无法在镜下直接看到，需要通过PCR法等进行检测才发现，出现污染后比较难发现。建议在养细胞每月检测一次并结合每周抽检，做到有污染早发现。对于正在进行支原体去除处理的细胞建议每周必检，直至出现阴性结果并至少维持一月。不同的细胞分开处理，优先处理「支原体阴性」细胞，后处理正在做去除处理的和受感染的细胞。
4. 黑胶虫污染
细胞培养过程中往往会出现黑胶虫污染现象，并且与细胞呈现此消彼长的现象，但是培养基却并不浑浊。可能会引起细胞生长迟缓或裂解凋亡，但黑胶虫问题目前还没定论，总结起来有以下几种说法：无机盐离子析出（多说为 Ca2+）；细胞碎片；支原体污染。针对以上说法可以采取以下方案：检查细胞状态，更换细胞株；更换血清，购买正品血清，质量、售后都有保障。
二、其他问题
1. 细胞培养过程中能更换成其它种类的培养液吗？
我们强烈建议使用细胞提供机构或细胞库推荐的生长培养液。另，有些细胞可能适合在不同培养液里生长，在做好保种或有细胞维持在原推荐培养条件下，可分出部分细胞做测试。
2. 细胞在培养过程中出现碎片如何处理？
贴壁细胞在移除原培养液后，用 PBS 液冲洗 2-3 遍；悬浮细胞离心移除原培养液后，加入 PBS 重悬，离心移除 PBS；一般建议重复上述步骤 2-3 遍，800-1000rpm 离心 3-5 分钟。
3. 细胞能放在-80℃ 保存吗？
长期保存的细胞应在液氮（-196℃）存放，短时间（一般 1-2 周）可以存放在-80℃。
三、污染预防策略
A 环境控制：细胞房
环境要求：洁净区 10000 级，局部 100 级，定期进行沉降菌检测
环境消毒：每周定期消毒灭菌
1）地面/墙面：84 消毒液、新洁尔灭交叉使用
2）环境消毒：定期紫外照射，臭氧熏蒸
3）仪器设备表面：75% 酒精擦拭
B 实验人员管理
上岗前对工作人员进行岗位培训，培训要点主要有：
着装：着无菌衣，戴口罩、手套，头发、手腕等要包好，减少皮肤外露。
行为：减少走动，出入关门，操作时不要讲话。
技能：养成良好的无菌操作习惯。
其他：减少共用物品，公共使用区域统一使用习惯，区分洁净区域和有风险的区域。
C 实验用品管理
试剂：使用前确保无菌，自己配制的试剂需过滤除菌后再使用。
耗材：需要重复使用的耗材确保按照规定清洗、高温高压灭菌，使用灭菌指示带。灭菌后烘干的耗材立刻放进超净台，一周内使用完毕，未使用完的，需重新灭菌再使用。
仪器设备：定期擦拭消毒，培养箱、显微镜托盘等高风险区域需经常清洁，培养箱水盘和复苏用的水浴锅需添加抑菌剂。
一、细胞污染
1. 细菌污染
细菌污染是细胞培养中最常见的污染，细菌在显微镜下呈黑色细沙状（如下图），典型特征是，可以使培养基在短时间内变成黄色或白色浑浊。细胞形态会出现多角，多核状况；贴壁细胞不附着，停止生长甚至死亡。
污染处理：杆菌可选用 100ug/ml 庆大霉素处理一周，颗粒状细菌可用 25ug/ml 环丙沙星处理一周，效果相对还不错。如果污染严重或有富余细胞种子，建议立即做丢弃处理，并对培养器材和细胞房环境进行全面消毒。
2. 真菌污染
细胞培养中最常见的污染真菌有：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。
污染处理：可用 100ug 两性霉素 B/T25 瓶，处理一周。
注：两性霉素毒性较大，需要在细胞有 50% 以上且状态没受大影响前处理。
3. 支原体污染
支原体是隐蔽的污染物，不能通过过滤去除。显微镜下没有任何可见的支原体污染迹象，比如细胞病变和浊度或 pH 值变化（即使在严重污染的培养基中），这样就会导致我们产生错误的安全感。而在牛血清中，支原体是最常见的微生物之一（本公司胎牛血清 Cellsera 采用 3 次 0.1μm 无菌过滤，成品经无菌及支原体检测合格，保证产品质量）。
支原体的预防与清除：由于支原体无法在镜下直接看到，需要通过PCR法等进行检测才发现，出现污染后比较难发现。建议在养细胞每月检测一次并结合每周抽检，做到有污染早发现。对于正在进行支原体去除处理的细胞建议每周必检，直至出现阴性结果并至少维持一月。不同的细胞分开处理，优先处理「支原体阴性」细胞，后处理正在做去除处理的和受感染的细胞。
4. 黑胶虫污染
细胞培养过程中往往会出现黑胶虫污染现象，并且与细胞呈现此消彼长的现象，但是培养基却并不浑浊。可能会引起细胞生长迟缓或裂解凋亡，但黑胶虫问题目前还没定论，总结起来有以下几种说法：无机盐离子析出（多说为 Ca2+）；细胞碎片；支原体污染。针对以上说法可以采取以下方案：检查细胞状态，更换细胞株；更换血清，购买正品血清，质量、售后都有保障。
二、其他问题
1. 细胞培养过程中能更换成其它种类的培养液吗？
我们强烈建议使用细胞提供机构或细胞库推荐的生长培养液。另，有些细胞可能适合在不同培养液里生长，在做好保种或有细胞维持在原推荐培养条件下，可分出部分细胞做测试。
2. 细胞在培养过程中出现碎片如何处理？
贴壁细胞在移除原培养液后，用 PBS 液冲洗 2-3 遍；悬浮细胞离心移除原培养液后，加入 PBS 重悬，离心移除 PBS；一般建议重复上述步骤 2-3 遍，800-1000rpm 离心 3-5 分钟。
3. 细胞能放在-80℃ 保存吗？
长期保存的细胞应在液氮（-196℃）存放，短时间（一般 1-2 周）可以存放在-80℃。
三、污染预防策略
A 环境控制：细胞房
环境要求：洁净区 10000 级，局部 100 级，定期进行沉降菌检测
环境消毒：每周定期消毒灭菌
1）地面/墙面：84 消毒液、新洁尔灭交叉使用
2）环境消毒：定期紫外照射，臭氧熏蒸
3）仪器设备表面：75% 酒精擦拭
B 实验人员管理
上岗前对工作人员进行岗位培训，培训要点主要有：
着装：着无菌衣，戴口罩、手套，头发、手腕等要包好，减少皮肤外露。
行为：减少走动，出入关门，操作时不要讲话。
技能：养成良好的无菌操作习惯。
其他：减少共用物品，公共使用区域统一使用习惯，区分洁净区域和有风险的区域。
C 实验用品管理
试剂：使用前确保无菌，自己配制的试剂需过滤除菌后再使用。
耗材：需要重复使用的耗材确保按照规定清洗、高温高压灭菌，使用灭菌指示带。灭菌后烘干的耗材立刻放进超净台，一周内使用完毕，未使用完的，需重新灭菌再使用。
仪器设备：定期擦拭消毒，培养箱、显微镜托盘等高风险区域需经常清洁，培养箱水盘和复苏用的水浴锅需添加抑菌剂。