Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡/周期检测试剂盒工作原理详解

试剂盒组成及作用

Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡/周期检测试剂盒主要包含 Annexin V-FITC、PI 和结合缓冲液。Annexin V-FITC 是将 Annexin V 与 FITC 标记形成的复合物，PI 是一种核酸染料。结合缓冲液含有钙离子，可为 Annexin V 与 PS 结合提供适宜环境，维持细胞状态稳定，减少非特异性结合。

工作原理

细胞膜的不对称性和 PS 的外翻

正常细胞膜的磷脂分布具有不对称性，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜内侧。细胞凋亡时，PS 会在早期从细胞膜内侧翻转到外侧，这一变化是检测细胞凋亡的重要标志之一。

Annexin V-FITC 与 PS 的结合

Annexin V 是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，对 PS 具有高亲和力。在细胞凋亡早期，Annexin V-FITC 可与外翻至细胞膜外侧的 PS 结合，从而识别早期凋亡细胞。

PI 的染色作用

PI 不能透过活细胞和早期凋亡细胞的完整细胞膜，但能透过晚期凋亡和坏死细胞的细胞膜，与细胞核中的 DNA 结合，使细胞核染色。通过 Annexin V-FITC 和 PI 的联合染色，可以区分活细胞（Annexin V-FITC-/PI-）、早期凋亡细胞（Annexin V-FITC+/PI-）、晚期凋亡细胞（Annexin V-FITC+/PI+）和坏死细胞（Annexin V-FITC-/PI+）。

检测方法

流式细胞术

流式细胞术是目前最常用的细胞凋亡检测方法之一，具有快速、灵敏、定量分析等优点。通过设置未染色组、PI 单染组及 Annexin V-FITC 单染组等对照，调整流式细胞仪的电压和光补偿后，可准确区分不同状态的细胞。Annexin V-FITC 的最大激发波长为 488nm，发射波长为 525nm，在 FL1 通道检测；PI-DNA 的最大激发波长为 535nm，发射波长为 617nm，在 FL2 或 FL3 通道检测。

荧光显微镜检测

对于悬浮细胞，可按照流式细胞术步骤操作后，将细胞悬液置于玻片上进行观察。对于贴壁细胞，可在孔板中放置细胞爬片，待细胞贴壁后进行诱导凋亡、染色等操作，再用荧光显微镜进行观察。在荧光显微镜下，早期凋亡细胞呈绿色荧光，坏死细胞呈红色荧光。