EMSA检测实验流程

EMSA检测实验流程

EMSA检测实验外包：15701002394

凝胶迁移实验（EMSA）用于研究蛋白质与特定DNA或RNA序列的相互作用。

一、实验准备

1. 实验材料

纯化的蛋白质样品、标记的核酸探针（可以是放射性标记如^{32}P，或非放射性标记如生物素）、结合缓冲液（含Tris-HCl、MgCl₂、EDTA、DTT、甘油、BSA等，pH通常7.5-8.0）、聚丙烯酰胺凝胶（依据核酸片段大小选择合适浓度，一般4-10%）、电泳缓冲液（如0.5×TBE）、上样缓冲液（含甘油、溴酚蓝等）、脱色液（乙醇:乙酸:水=10:1:89）、显影液（若使用放射性标记）或链霉亲和素-HRP及化学发光底物（若使用生物素标记）。

2. 实验设备

垂直电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统（非放射性标记用）、放射自显影设备（放射性标记用）、离心机、水浴锅或PCR仪。

二、实验步骤

1. 探针标记

若使用非放射性标记，按照生物素标记试剂盒说明书，将生物素标记到核酸探针上；若是放射性标记，在合适反应体系中，利用激酶等将^{32}P标记到探针末端，标记后通过柱层析等方法纯化探针 。

2. 蛋白质-核酸结合反应

在微量离心管中依次加入适量结合缓冲液、蛋白质样品（设不加蛋白的对照组）、标记的核酸探针，轻轻混匀，总体积一般为10-20μL。室温或特定温度（依据研究的蛋白-核酸相互作用特性，常见25℃孵育20-30分钟，促进蛋白质与核酸结合形成复合物。

3. 聚丙烯酰胺凝胶制备

根据实验需求，选择合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶，按比例混合丙烯酰胺、双丙烯酰胺、TBE缓冲液、过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED），快速混匀后灌胶，插入梳子，待凝胶凝固。

4. 上样与电泳

在结合反应体系中加入适量上样缓冲液，混匀后上样到凝胶孔中。在0.5×TBE缓冲液中进行电泳，设置合适电压（如100 - 150V），使游离探针与蛋白质-核酸复合物有效分离，溴酚蓝迁移至凝胶底部附近结束电泳。

5. 转膜（非放射性标记适用）：若为非放射性标记，电泳结束后将凝胶中的核酸-蛋白质复合物转移到尼龙膜上，可采用半干转或湿转法，转膜条件依据转膜仪说明书设置。

6. 检测非放射性标记

转膜后的尼龙膜用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1小时，洗膜后与链霉亲和素-HRP孵育1小时，再次洗膜，加入化学发光底物，在凝胶成像系统中曝光成像。