Fluo-3AM荧光探针检测钙离子实验流程

Fluo-3AM荧光探针检测钙离子实验流程

实验外包：15701002394

一、实验准备

1. 实验材料

含有钙离子的待测样本（如细胞悬液、生物体液、缓冲溶液等）、荧光探针（如Fluo-3AM、Fura-2AM等，根据实验需求选择，以Fluo-3AM为例）、无水DMSO、HEPES缓冲液（含130mm NaCl、5mm KCl、1mm MgCl₂、2mm CaCl₂、10mm HEPES，pH7.4用于配制工作液及清洗样本）、牛血清白蛋白（BSA）、96孔黑色酶标板（用于荧光检测）。

2.仪器设备

荧光微孔板读数仪、离心机、移液器（量程涵盖0.1-1000 μL）、涡旋振荡器、37℃恒温培养箱、冰箱（用于储存试剂）。

二、试剂配制

1. Fluo-3AM储备液

准确称取适量Fluo -3AM，用无水DMSO溶解，配制成1-5mm的储备液，避光保存于-20℃冰箱。

2. 工作液配制

使用前，将Fluo-3AM 储备液用含 0.02% BSA的HEPES缓冲液稀释至所需工作浓度（一般为5-20μM），现用现配。

三、样本准备

1. 细胞样本

若为贴壁细胞，用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，离心（1000 rpm，5min）收集细胞，用HEPES缓冲液洗涤2-3次；若为悬浮细胞，直接离心收集并用HEPES缓冲液洗涤。调整细胞浓度至合适范围（如1×10⁶-5×10⁶cells/mL）。

2. 生物体液样本

如血清、血浆等，需进行适当稀释，一般稀释倍数为 10 - 100 倍，以避免高浓度背景干扰荧光信号。

四、负载荧光探针

1. 取适量处理好的样本，加入等体积的Fluo-3AM工作液，轻轻混匀，使最终探针浓度为2.5-10μM。

2. 将混合液转移至离心管中，37℃恒温孵育30-60min，期间每隔10-15min 轻轻涡旋振荡，确保探针均匀负载进入细胞或与样本充分结合。

3. 孵育结束后，离心（1000-1500 rpm，5-10 min），弃上清，用HEPES缓冲液洗涤2-3次，去除未负载的荧光探针。

五、荧光检测

1. 将洗涤后的样本重悬于适量HEPES缓冲液中，取100 - 200 μL加入到96孔黑色酶标板中。

2. 设置荧光微孔板读数仪参数，激发波长一般为488 nm（针对Fluo-3AM），发射波长为525nm左右；设置合适的积分时间和增益值，以获得稳定且准确的荧光信号。

3. 将酶标板放入读数仪中，读取每个孔的荧光强度，记录数据。