Co-ip检测实验流程

 

co-ip实验外包：15701002394

一、实验准备

1、材料

细胞系（表达目的蛋白及可能相互作用蛋白）。

2、试剂

RIPA裂解缓冲液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PBS缓冲液、Protein A/G磁珠、抗体（针对目的蛋白和对照IgG）、洗脱缓冲液、SDS-PAGE相关试剂、Western blot相关试剂。

3、仪器

低温离心机、恒温摇床、磁力架、超声破碎仪、电泳仪、转膜仪、化学发光成像系统。

二、细胞培养与裂解

1、细胞生长至对数期，用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，去除培养液中的血清及杂质。

2、向培养皿中加入适量含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液，置于冰上孵育30分钟，期间轻轻晃动培养皿，使裂解液与细胞充分接触。

3、用细胞刮刀将细胞从培养皿表面刮下，收集细胞裂解物至离心管中。

4、4℃，12000g离心15分钟，取上清，即为细胞总蛋白裂解液。

三、免疫沉淀

1、取适量细胞总蛋白裂解液，将其分为两组，一组加入针对目的蛋白的特异性抗体，另一组加入等量的对照IgG，4℃缓慢摇晃孵育过夜，使抗体与目的蛋白充分结合。

2、取适量Protein A/G磁珠，用PBS缓冲液洗涤3次，每次洗涤后用磁力架分离磁珠，弃上清。

3、将孵育过夜的蛋白裂解液与洗涤后的Protein A/G磁珠混合，4℃孵育2-4小时，使抗体-目的蛋白复合物与磁珠结合。

四、洗涤与洗脱

1、用磁力架分离磁珠，弃上清，加入预冷的PBS缓冲液洗涤磁珠-蛋白复合物3-5次，每次洗涤后充分混匀，磁力架分离，去除未结合的杂质蛋白。

2、向洗涤后的磁珠中加入洗脱缓冲液，室温孵育5-10分钟，期间轻轻晃动离心管，然后用磁力架分离，收集上清，上清中即含有洗脱下来的目的蛋白及与之相互作用的蛋白。

五、SDS-PAGE与Western blot检测

1、将洗脱得到的蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸5分钟使蛋白变性。

2、进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白分子量大小分离蛋白。

3、电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。

4、用5%脱脂奶粉或BSA封闭液室温封闭膜1-2小时，以减少非特异性结合。

5、加入针对目的蛋白或可能相互作用蛋白的一抗，4℃孵育过夜。

6、次日，用TBST缓冲液洗涤膜3-5次，每次10分钟，去除未结合的一抗。

7、加入相应的二抗，室温孵育1-2小时。

8、再次用TBST缓冲液洗涤膜3-5次，每次10分钟。

9、加入化学发光底物，在化学发光成像系统下曝光、显影，分析目的蛋白与其他蛋白是否存在相互作用。