研究背景：
心房颤动（AF）是最常见的心律失常疾病，最近研究阐明了心房心肌病（ACM）是房颤发生的原因之一，进而造成心房血栓形成和卒中。然而，心房病变复杂而持久的致病过程仅被实验模型部分复制，其潜在的分子行为和信号通路仍知之甚少。

大型动物（山羊、猪和狗等）是房颤研究的重要模型，这些模型构建通常是快速心房起搏或人工诱导二尖瓣功能不全，成功率较低、花费较高，而鼠的模型构建更节省成本。但小鼠在没有程序化电刺激的情况下通常不会发生房颤，具有自发性房颤的模型需要基因修饰来诱导稳定和可遗传的重构。

启动子中的 cAMP 响应元件（CRE）与 cAMP 响应元件蛋白（CREB）和 cAMP 响应元件调节器（CREM）作为二聚体结合，该二聚体控制下游信号分子的活性，参与转录信号通路。CREM 的一种 IbΔC-X 亚型，Muller 教授等人利用 TALEN 系统开发了一个表达 CREMIbΔC-X 的转基因小鼠模型。这些转基因小鼠表现出包括心房增大、自发性房颤和左心室肥厚等心脏表型。功能分析显示该模型中心房纤维化、传导系统受损、肌浆网 Ca2+渗漏增加。因此，CREM-IbΔC-X 是一个合适的靶基因，具有广泛调控功能参与发病机制。

CRISPR/Cas9 系统是一种简单、快速的工具，它可以有效地修饰不同物种和细胞类型的内源性基因。本研究的目的是利用 CRISPR/Cas9 技术生成心脏特异性的 CREM-IbΔC-X 转基因小鼠（称为 CS-CREM 小鼠）。

 

实验结果：
房颤患者心房组织中 CREM-IbΔC-X 的表达增加
CREM-IbΔC-X 是 CREM 转录因子的一种亚型，是 cAMP 信号传导的抑制因子。转录组学研究表明，CREM/ATF1 家族靶基因的下调与人类 AF 易感性相关。为了进一步研究 CREM-IbΔC-X 在房颤患者中的表达水平，获取了窦性心律患者和房颤患者的心房组织。

首先进行免疫荧光染色，检测 panCREM 蛋白的表达（图 1A）。结果表明，房颤患者心房样本中泛 CREM 蛋白的表达普遍较高。同时检测 CREM 蛋白及其亚型的表达（图 1B）。结果一致显示，与野生型 CREM 蛋白及其亚型对应的 3 条主要条带（～37、30 和 20 kDa）在 AF 组中更为明显。使用 qPCR 评估了 CREM-IbΔC-X 亚型的 mRNA 水平（图 1C）。结果显示，在房颤患者的心房标本中，CREM-IbΔC-X 亚型的表达明显增加。

Figure 1.房颤患者心房样本中CREM-IbΔC-X蛋白表达的验证
 

利用 CRISPR/Cas9 技术构建 CS-CREM 小鼠
在本研究中，作者使用 CRISPR/Cas9 系统在小鼠（称为 CS-CREM 小鼠）中诱导心脏特异性的 CREM-IbΔC-X 过表达。

靶向策略如图 2A 所示，通过 CRISPR/Cas9 基因编辑，将靶基因成功整合到小鼠 H11 染色体中。对三种高危 sgrna 进行了可能的脱靶效应试验，研究表明在 CS-CREM 小鼠中脱靶效应和随机插入 CREM-IbΔC-X 在 C-CREM 小鼠中是不可见的。  

野生型和转基因小鼠表现出相同的外观和大小（图 2B）。为了鉴定小鼠的基因型，作者使用特异性引物序列扩增 DNA，野生型（412 bp）和靶向小鼠（307 bp）产生不同的条带，如图 2C 所示。

生存分析显示，纯合子小鼠的寿命不到一个月；杂合子小鼠与野生型小鼠之间的生存曲线无统计学差异（P > 0.05，图 2D）。5 只产后杂合子雌性小鼠中有 4 只在出生后死亡，高于平均死亡率。可能怀孕增加了心脏负担，导致心力衰竭、产后死亡。因此，将雄性杂合子小鼠与雌性野生型小鼠交配，产生杂合子后代，同时验证了杂合子小鼠的 CREM-IbΔC-X 基因在子代中稳定表达。

Figure 2. 靶向插入CREM-IbΔC-X并生成CS-CREM小鼠
 

CS-CREM 小鼠的心房电生理重构
本研究的重点主要是杂合子小鼠和野生型小鼠之间的差异。心电图显示，与野生型小鼠相比，杂合子小鼠的 p 波振幅明显降低，而 p 波持续时间无统计学差异（图 3B-C）。在 12 周龄时，与野生型小鼠相比，杂合子动物的心房早搏负荷显著增加（P = 0.0128，图 3D）。此外，在 8 周龄时，1 只杂合子小鼠在常规心电图检查中发生了房颤，在 16 周时发生房颤的概率为 20%（9/41）。随着小鼠年龄的增长，杂合子 CS-CREM 小鼠中 AF 的患病率增加。到 28 周时，60%（25/41）的杂合子小鼠发生了 AF。log-rank 13 检验显示，两条无 AF 生存曲线之间的差异有统计学意义（P < 0.0001，图 3E）。

为了进一步探索 CS-CREM 动物自发性房颤的电生理特性，作者对 20 周龄野生型（wt）和杂合子（ki/wt）小鼠的心房进行了评估。结果显示，ki/wt 小鼠的心房表现出不均匀的电传导，如自发节律和 8 Hz 起搏下的折返（图 3F）。传导速度的计算表明，ki/wt 小鼠心房电传导速度明显低于年龄匹配的野生型小鼠自发（0.90 ± 0.046 mm/s vs. 1.27 ± 0.22 mm/s，P = 0.0459）和 8 Hz（0.71 ± 0.024 mm/s 与 1.10 ± 0.23 mm/s，P = 0.0392）（图 3 G-H）伴随心房有效不应期的显著延长（图 3I，42.733 ± 5.93 ms 与 30.83 ± 1.04 ms，P = 0.0268）。

Figure 3. CS-CREM小鼠的心房电生理重构
 

CS-CREM 小鼠的心房结构重构
考虑到心房病变可形成房颤的底物，作者利用超声心动图和 Masson 染色对 CS-CREM 小鼠的心房结构重构进行进一步的研究。分别在出生后 12 周、20 周和 28 周进行超声心动图检查。在后两个时间点，与年龄匹配的野生型对照组相比，杂合子 CSCREM 小鼠显示出明显的心房增大。12 周后，野生型小鼠的心房大小并不随年龄的增长而增加。然而，杂合子 CS-CREM 小鼠的心房大小随着时间的推移逐渐增大（12 周 vs. 28 周，P = 为 0.0266）。

在同一时间点进行 Masson 染色，以评估 CS-CREM 和野生型对照小鼠的心房纤维化（图 4A）。杂合子与野生型对照组相比，年龄匹配的 CS-CREM 小鼠表现出心房纤维化显著增加。此外，杂合子和野生型小鼠在 12 周和 28 周之间均表现出心房纤维化的增加趋势，但只有杂合子小鼠具有统计学意义（P < 0.0001，图 4D）。与心房重构相反，心室纤维化没有显著性差异，从 12-28 周，杂合子 CS-CREM 小鼠的射血分数在 50% 左右波动，但保持不变。本研究结果提示，衰老可能会促进 CS-CREM 小鼠的心房纤维化并进行了实验验证。

Figure 4. CS-CREM小鼠的心房结构重构
 

CS-CREM 小鼠的蛋白质组学研究
为了探讨 CS-CREM 小鼠心房病变的潜在机制，作者进行了蛋白质组学分析。收集 28 周龄杂合子小鼠（ki/wt，n = 4）和野生型小鼠（wt，n = 4）的心房样本进行蛋白质组学实验。结果显示，共表达了 786 个不同的蛋白，其中 365 个蛋白显著上调，421 个蛋白显著下调（P 值 0.05，foldvhange1.5）。蛋白质组学分析显示，与年龄匹配的野生型小鼠相比，CS-CREM 小鼠中 Myl4 和 Nppa 表达下调。对 CS-CREM 小鼠中上调基因的分析显示，与病灶粘附和血小板活化相关的基因强烈富集（图 5C）。下调基因的富集图谱显示，在 CS-CREM 小鼠中，有多种受影响的代谢过程，特别是脂肪酸降解和氧化磷酸化代谢（图 5D），这与使用来自 ACM 患者的心房样本进行的宝贵的蛋白质组学研究一致。通过 ChIP-qPCR 进一步探索了 CREM-IbΔC-X 可调控的下游基因，发现 CREM-IbΔC-X 在 Myl4 和 Nppa 的启动子区域显著富集（图 5E-F）。

Figure 5.CS-CREM和野生型对照小鼠的蛋白质组学分析
 

CS-CREM 小鼠的药物反应
为了评估 CS-CREM 小鼠模型中对抗心律失常药物的反应，作者使用了胺碘酮（III 类）和普罗帕酮（Ic 类），参考之前关于动物干预药物剂量的研究。房颤小鼠尾静脉注射 5 mg/kg 胺碘酮，如图 6A 所示，胺碘酮有效地为所有模型终止了房颤的发作（5/5），并恢复了持续至少 5 分钟的窦性心律（图 6C-D)。同样，1.5 mg/kg 的普罗帕酮（图 6B）也成功地终止了 CS-CREM 小鼠中 AF 的发作（4/4），并维持了大约 5 分钟的窦性心律（图 6C-D）。总之，CS-CREM 小鼠显示出作为体内药物试验的理想 AF 模型的前景。

Figure 6. 静脉注射胺碘酮和普罗帕酮终止CS-CREM小鼠的AF
 

结论：
研究通过在小鼠中心脏特异性过表达 CREM-IbΔC-X，建立了一个新的 ACM 模型。CS-CREM 小鼠代表了一种稳定、经济、通用的模型，在研究 ACM 的机制和治疗靶点具有很大前景。​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​​