大小鼠跳台记录系统 | 多奈哌齐通过减少HDAC6核转位而增加BDNF来减轻大鼠血管性痴呆

为了研究多奈哌齐在慢性脑缺血（CCH）中的认知恢复作用，作者通过水迷宫测试（MWM）来评估学习和记忆功能。所有大鼠的逃避潜伏期都呈现出逐渐减少的趋势（图1b）。并且所有组之间的游泳速度没有差异（图1d），这表明BCCAO并未损害运动能力。接下来，作者通过跳台测试检测大鼠的工作记忆（图1e），BCCAO模型组显示出更高的错误率，而多奈哌齐治疗的大鼠与BCCAO模型组相比，错误率降低。综合以上结果，验证了BCCAO模型中认知障碍和记忆退化的建立。此外，这些结果表明多奈哌齐减轻了BCCAO引起的学习和记忆障碍。

作者通过尼氏染色探究大脑中的神经退行性变（大脑皮层图2a；海马图2c）。在BCCAO模型组中，观察到大鼠皮质、海马神经元结构发生紊乱、核萎缩、神经元细胞暗染等病理变化。经过多奈哌齐治疗后，神经退行性变减轻（图2b，图2d）。

接下来通过高尔基染色检测皮层（图2e）和海马（图2f）树突棘密度。结果显示，与假手术组相比，BCCAO模型组的皮层和海马中树突棘密度减少。多奈哌齐治疗增加了BCCAO组的树突棘密度。

脑源性神经营养因子（BDNF）在神经元形成中起着重要作用，保护神经元细胞并维持神经可塑性。作者发现，与假手术组相比，BCCAO减少了皮层和海马中BDNF mRNA和蛋白的表达，而多奈哌齐治疗增加了BDNF mRNA和蛋白的表达（图2g-j）。

图2. 多奈哌齐减轻神经退行性变，增加BDNF表达

尽管多奈哌齐恢复了皮层和海马中BDNF mRNA和蛋白的表达，但之前的结果显示皮层中BDNF的恢复大于海马中的恢复，这暗示了BDNF表观遗传学上的差异。HDAC6的核转位是调节晚发型AD中BDNF表达的关键步骤。免疫荧光染色显示，BCCAO增加了HDAC6的核定位，而多奈哌齐降低了细胞核中HDAC6的水平（图3a-b）。为了研究HDAC6的分离，作者接下来检测了细胞核和细胞质中HDAC6的表达。与假手术组相比，BCCAO增强了细胞核中HDAC6的水平，在皮层中多奈哌齐降低了细胞核中HDAC6的水平，然而，在海马中模型组和多奈哌齐组之间没有显著差异。细胞质中HDAC6表达没有检测到显著差异。（图3c-f）

图3. 多奈哌齐减少了HDAC6在皮层中的核转位

作者之前指出多奈哌齐增加了皮层和海马中BDNF的表达，并且多奈哌齐减少了皮层中HDAC6的核转位，而在海马中没有明显变化。为了更深入地理解多奈哌齐通过HDAC6对BDNF的调节，作者进行了ChIP实验以研究HDAC6与BDNF启动子(P-I、P-III、P-IV和P-VI)之间的关联。在皮层和海马中，P-III和P-IV与BCCAO模型组的HDAC6明显相关。在皮层和海马中，P-III与多奈哌齐组的HDAC6相关。P-IV与多奈哌齐组海马中的HDAC6相关，但在皮层中没有检测到。PCR结果表明HDAC6与BDNF启动子III和BDNF启动子IV相关。作者进行了qPCR以进一步研究与BDNF启动子III和BDNF启动子IV相关的HDAC6的数量。在皮层中，BDNF启动子III和BDNF启动子IV的倍数变化在BCCAO模型组中大，多奈哌齐治疗降低了BDNF启动子IV的水平（图4c、e），但没有改变BDNF启动子III的水平。在海马中，BCCAO模型组中BDNF启动子III和BDNF启动子IV的水平增强。然而，在海马中多奈哌齐治疗后，与HDAC6相关的BDNF启动子IV没有观察到显著差异。

图4. 多奈哌齐可调节HDAC6与BDNF启动子IV的关联

之前的结果显示，多奈哌齐并未通过HDAC6在海马中调节BDNF。然而，与BCCAO模型组相比，多奈哌齐组海马中BDNF的mRNA和蛋白表达增加，这暗示了多奈哌齐可能通过其他途径在海马中调节BDNF。氧化应激是神经退行性变的一个重要因素，而活性氧（ROS）是氧化应激的主要因素。DHE可以被细胞内的ROS氧化，并被纳入染色体DNA中产生红色荧光。红色荧光的产生和荧光强度代表了ROS的水平。在皮层和海马中，模型组检测到明显的红色荧光，而多奈哌齐治疗减弱了荧光（图5a-c）。

AMPK和AKT是神经活动、代谢信号通路和线粒体活动调节中的关键酶。作者检查了皮层和海马中p-AMPK、AMPK、p-AKT和AKT蛋白的表达。在皮层和海马中，BCCAO降低了p-AMPK/AMPK的比例，而多奈哌齐治疗恢复了AMPK的磷酸化水平（图5d,f）。在皮层和海马中，BCCAO降低了p-AKT/AKT的比例，然而，多奈哌齐治疗仅在皮层中恢复了AKT的磷酸化，在海马中未检测到AKT磷酸化的变化（图5e,g）。

图5.多奈哌齐降低BCCAO大鼠的ROS水平，激活皮层中的AMPK和AKT