小动物跑步机 | 陆军军医大学李旻典/张志辉发现改变进食时间增强体能的分子机制

为了确定有助于运动调节的脂肪细胞固有的节律性通路，作者采用了深度覆盖的定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学方法（或diaPASEF），并对时间限制喂食（TRF）的雌性小鼠的性腺周围白色脂肪组织（GWAT）进行多组学分析（图1A）。GWATs每4小时从9周龄的C57BL/6J雌性小鼠中解剖出来，这些小鼠已经接受了日间限食（DRF）或NRF喂养7天。

在DRF期间，Nono和Wdr5的日常平均水平低于NRF期间。通路分析显示，核糖体、胰岛素信号和AMPK信号通路是上调最显著的通路之一（图1B），而糖鞘脂生物合成和溶酶体通路则是下调最显著的通路之一（图1C）。

作者根据在蛋白质组学分析中检测到的蛋白质，从mRNA中提取昼夜统计数据并进行比较分析。作者发现，在DRF期间，80.4%的节律性蛋白质表现出24小时的新节律（图1D）（图1E）。与线粒体相关的新生节律（DNR）蛋白质被富集到11个功能簇中，包括氧化磷酸化和脂肪酸代谢过程（图1F）。在NRF期间，GWAT中有58.5%的节律性蛋白质是DNR（图1G）（图1H）。此外，与NRF相比，DRF下获得新生昼夜节律的脂质类别更多（图1K）。总之，作者确定了线粒体能量代谢和中性脂质代谢是与GWAT中DRF相关的显著新生昼夜特征。

GWAT内mRNAs与蛋白质之间的昼夜节律不一致，提示翻译后修饰（如磷酸化）可能参与其中。核心时钟基因的表达谱分析显示，与ALF或NRF相比，肝脏时钟完全适应了DRF。昼夜节律的对齐喂养或NRF使最多的节律性位点呈现节律性，其次是DRF，最后是ALF（图2A）。与ALF或NRF相比，DRF显著降低了来自昼夜节律时钟的昼夜位点的幅度（图2C）。

相位集富集分析发现DRF通路在睡眠期聚集，而NRF和ALF的通路主要限制在活跃期（图2F）。mTOR信号通路和PPAR信号通路是DRF期间得分最高的信号通路（图2G）。

与NRF或ALF相比，AMPK信号通路是DRF期间最上调的信号通路（图2H）。在骨骼肌中，胰岛素/mTOR信号通过mTOR介导的AMPKa2（由Prkaa2编码）在Ser377处的磷酸化激活AMPK。p-Prkaa2在DRF和NRF期间均呈现节律性，并且在DRF和NRF之间相位相反（图2I）。总之，磷酸化蛋白质组学分析揭示了营养感应通路在TRFs期间昼夜节律中的核心作用，其中AMPKa2信号通路被DRF诱导并适应喂养节律。

接下来，作者测试了脂肪细胞AMPKa2信号通路对运动表现有贡献的假设。作者采用AMPK复合体的脂肪细胞特异性基因敲低模型，在运动表型分析中， Prkaa2FKD小鼠总体上表现出更差的跑步耐力，尤其是在DRF下（图3B）。脂肪细胞中Prkaa2的敲低阻止了与DRF相关的跑步耐力的增加，并未改变氧化纤维和糖酵解纤维之间的肌肉纤维类型转换（图3C）。

为了测试脂肪时钟是否调节运动表现，作者在雌性小鼠中生成脂肪特异性的核心时钟基因敲低模型。ClockFKD在ZT0时降低了Bmal1和Clock的水平（图3D）。在从ALF切换到DRF时，ClockFKD小鼠在耐力跑步方面表现出较差的反应，而Bmal1FKD和对照小鼠在切换后耐力增加，这表明DRF至少部分通过脂肪细胞时钟系统增强了跑步耐力（图3E）。总之，这些结果表明，脂肪细胞AMPKa2信号通路在DRF期间调节跑步耐力。

图3. 限时喂食通过脂肪细胞AMPKa2信号通路增强耐力

为了确定由脂肪细胞AMPKa2调控的脂肪-肌肉信号传导的介质，作者分析了DRF喂养的小鼠中脂肪细胞Prkaa2表达缺失的血清代谢组。N-乳酰苯丙氨酸（Lac-Phe）和尿苷是在对照和Prkaa2FKD小鼠中分别检测到的节律性血清代谢物（图4B）。在Prkaa2FKD和对照小鼠共享的180种节律性代谢物中，只有少数代谢物受脂肪细胞AMPKa2信号传导的调控（图4D）。在Prkaa2FKD组中，Lac-Phe失去节律性，而尿苷则获得节律性。这些发现共同表明，脂肪细胞AMPKa2信号传导调节了对代谢调控至关重要的关键生物化学介质的昼夜节律。

接着，作者确定了脂肪细胞AMPK缺乏对昼夜脂质组的影响。在定量的823种脂质中，发现Prkaa2FKD小鼠和对照小鼠的GWAT中分别有139和101种脂质在ZT0和ZT12之间存在差异。在对照组的暗-光转换（ZT0）聚类中，游离脂肪酸（FFA）是具有最大昼夜差异的单一脂质类别（图4F）。然而，Prkaa2FKD小鼠的GWAT中差异FFAs数量显著减少（图4F）。相反，在对照组的光-暗转换（ZT12）聚类中，甘油三酯（TAG）是具有最大昼夜差异的单一脂质类别（图4G）。并且与对照小鼠相比，TAGs的昼夜差异消失（图4G）。

长链酰基辅酶A（CoA）是甘油三酯合成和脂解通量的指标。通过质谱对酰基辅酶A进行昼夜分析发现，Prkaa2FKD小鼠在ZT0时酰基辅酶A含量显著更高（图4H）。

图4. 脂肪细胞AMPKa2调节系统和组织代谢组

通过检测核心时钟基因的昼夜表达，作者发现Prkaa2的敲低并未改变多数时钟基因的节律性，这表明，在ALF期间，脂肪细胞AMPKa2可能通过与小鼠肝脏中经典的AMPKa1/2-CRY1轴不同的机制发挥作用。为了探究长链酰基辅酶A的昼夜代谢是否是DRF期间脂肪细胞AMPKa2的作用靶点，作者对涉及长链酰基辅酶A代谢的33个基因进行了综合分析。该分析确定了六个符合这一标准的基因，即Fasn、Acacb、Slc27a1、Dgat1、Acsl1和Hsl（图5A）。

Prkaa2FKD小鼠在DRF期间GWAT中Slc27a1和Dgat1基因失去了昼夜节律性，而Acsl1转录本仍保持稳定的节律性（图5B）。因此，在DRF期间，Slc27a1和Dgat1是在脂肪细胞AMPKa2控制下的稳定昼夜节律基因。磷酸化蛋白质组分析确定了在DRF期间p-Srebf1（S96/S115）和p-Crtc2（S622/S70）的昼夜节律（图5E）。这些发现表明，AMPKa2调节了GWAT中Slc27a1和Dgat1的节律性表达，这与酰基辅酶A代谢、Srebf1和Crtc2的节律性活性相协同。

为了确定脂肪细胞AMPKa2信号是否因DRF而调节肌肉组织中的昼夜节律，作者比较了DRF期间GWAT和肌肉中的节律性组学谱。相位集富集分析显示，白色脂肪和肌肉组织中发现的节律性基因在许多生物通路中得到富集。因此，DRF期间肌肉中脂质代谢、细胞信号和线粒体功能的昼夜节律与GWAT中的节律同步。

肌肉Bmal1对于DRF下的运动表现至关重要，PGC-1a是一个昼夜节律基因，也是线粒体生物发生和代谢的主要调节因子。接下来，作者对DRF喂养的脂肪细胞Prkaa2缺乏小鼠的肝脏和腓肠肌进行RT-qPCR分析。Prkaa2FKD并未改变肝脏中Bmal1的昼夜表达；然而，它显著降低了肌肉中Bmal1节律的幅度。与之相符的是，Prkaa2FKD在DRF期间消除了肌肉中PGC-1a的节律性表达，但在肝脏中并未消除。这些数据表明，脂肪细胞AMPKa2信号的缺乏会损害DRF期间的肌肉时钟及其控制的代谢调节因子PGC-1a。

鉴于上述发现，作者推测在喂食/睡眠期末端（ZT12）建立AMPK激活可能参与调节DRF期间的运动表现。因此，作者探讨了二甲双胍或特定的AMPK激活剂是否以一天中的时间为依赖方式影响DRF期间的运动表现（图7A）。结果发现，在ZT12口服二甲双胍后，显著降低了跑步耐力；然而，这种效果与较低的体重有关。接下来作者测试靶向脂肪细胞AMPKa2的昼夜效果。

吡唑啉衍生物C29激活脂肪细胞AMPK以对抗代谢疾病。每两天在ZT12口服灌胃C29显著增加了跑步耐力（图7B）。Prkaa2FKD或Crtc2FKD消除了C29处理与耐力相关的时间效应（图7C）。C29-ZT12显著增加了肌肉中氧化型肌纤维的百分比（图7E）。C29-ZT12以脂肪细胞Prkaa2依赖性方式在ZT4时调节肌肉中核心时钟基因的表达，但在ZT8时没有这种调节（图7F），这表明肌肉时钟存在跨器官调节，由昼夜定时的脂肪细胞AMPK激活介导。总之，这些发现表明，通过特定的AMPK激活剂C29在昼夜定时激活脂肪细胞AMPKa2信号可增加小鼠的运动表现和肌肉功能。