果蝇嗅觉逃避记忆实验 | 开心散对Aβ42转基因果蝇认知功能的谱效关系及其活性成分的验证

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 阿尔茨海默病（AD）是一种中枢神经系统的退行性疾病，在临床上，AD的标志性特征包括记忆减退和认知障碍。全球每3秒就有一例新的AD病例被诊断出来，这凸显了其作为重大公共卫生问题的地位，并对人类健康产生了严重的负面影响。这进一步强调了开发有效治疗AD方法的迫切需求。AD的病理机制极为复杂，其确切病因尚不清楚。黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）因其短生命周期、快速繁殖和基因组被充分绘制而被广泛用作遗传模型生物。通过在果蝇大脑中表达与AD相关的蛋白，已建立了许多AD模型。Aβ42转基因果蝇在其大脑中表达人类Aβ42蛋白，表现出学习和记忆能力下降、寿命缩短以及大脑区域的退行性变化。 
 开心散（KXS）最早记录于唐代孙思邈的《备急千金要方》，主要用于治疗心神不宁、健忘、失眠和严重心悸。现代药理学研究表明，开心散具有抗AD、抗抑郁、抗炎和改善睡眠障碍的特性。然而，开心散的化学复杂性以及由于产地、储存和收获季节等因素导致的药效变化，给质量和疗效的一致性带来了挑战。 
 在本研究中，利用HPLC技术为开心散开发了指纹图谱。以Aβ42转基因果蝇模型和记忆表现作为指标，通过灰色关联分析、双变量相关分析和偏最小二乘回归分析谱效关系。这一分析阐明了开心散的药效物质基础，建立了质量标准，并确保了质量和疗效的一致性。此外，这些发现为新药的开发和制备技术的优化提供了坚实的基础。
    
 
  1. HPLC方法验证       以α-细辛醚峰（峰0）为参照峰，精密度的相对标准偏差（RSD）范围为0%到0.6%，重现性为0.1%到0.5%，稳定性为0%到1.3%。结果显示，指纹图谱中每个色谱峰的相对峰面积的RSD均小于2%。HPLC方法表现出优异的准确性，且开心散样品溶液在24小时内保持稳定。这些结果表明，所开发的HPLC指纹方法具有优越的重现性。     
 
 2. 开心散指纹图谱的建立       如图1所示，在规定的色谱条件下，获得了混合对照品溶液（图1A）、KXS测试样品（图1B）以及每一批KXS（图1C）的色谱图。通过比对对照品峰的紫外光谱和保留时间，在0-120分钟范围内识别出17个共有峰。鉴定出8种成分：远志黄酮III（b）、3-6-二芥子酰蔗糖（d）、人参皂苷Rg1（f）、人参皂苷Rb1（m）、β-细辛醚（n）、α-细辛醚（o）、去氢土莫酸（p）和去氢猪苓酸（q）。     
 
 3. 指纹相似性分析       为评估样品的相似性，对15批KXS的指纹色谱图与参考色谱图进行了比较分析。大多数样品表现出高相似性，数值接近或超过0.99。表明这些批次的化学组成和相对含量一致，质量稳定，生产工艺控制良好。然而，S1批次的相似度为0.887，相对较低，可能由于原材料、加工或储存的微小差异导致化学成分的轻微变化。尽管如此，整体相似度仍较高，表明偏差在可接受范围内。 

     图1. 15批开心散的HPLC指纹图谱     
 4. 层次聚类分析（HCA）       本研究采用SPSS统计软件中的层次聚类分析（HCA）功能，使用组间连接法对15批开心散（KXS）的指纹图谱进行分析。HCA用于评估KXS HPLC指纹的相关性。生成HCA树状图（图2A）和热图（图2B）。热图中的每个颜色单元对应一个数值矩阵。如图2所示，共识别出四个聚类。S1、S2、S3、S5、S6、S10、S11、S13、S14和S15形成一个组；S9和S8形成另一个组；S4形成一个独立的组；S12和S7形成最后一个组。HCA结果表明，不同批次的KXS样品具有相似的指纹图谱，但化学成分的峰面积存在差异，表明化学成分含量存在变化。HCA能够在化学水平上有效区分样品。 
    

 图2. 开心散HPLC指纹图谱中共有峰面积的层次聚类分析     
 
 5.KXS干预实验中时间效应和剂量效应关系的研究结果       实验结果表明，除了0.25%和0.5%的KXS组无效外，其他所有浓度的KXS均显著提高了Aβ42转基因果蝇的表现指数（PI）（图3A）。同样，除了处理1天、2天和3天的组外，其他所有处理时间组也显示出PI的改善（图3B）。基于这些结果，确定最佳给药浓度为1% KXS，处理时间为4天。 
  

   图3. 开心散对Aβ42转基因果蝇I性能指标的影响     
 
 6.15批KXS样品对Aβ42转基因果蝇记忆能力的改善作用       如图4所示，15批KXS样品均对Aβ42转基因果蝇的认知障碍表现出改善作用。然而，不同样品在认知改善程度上存在差异。这种差异可能归因于样品化学组成的差异。因此，进一步研究了谱效关系。 
    

 图4. 15批开心散对Aβ42转基因果蝇性能指标的影响     
 
 7. 谱效关系分析       灰色关联分析（GRA） 灰色关联分析（GRA）是一种用于确定每种化学成分与药物疗效之间关联强度的多因素统计技术。相关系数的范围为0到1，数值越高，表明与认知障碍改善的关联越强。较高的相关系数意味着成分与药物疗效之间的联系越紧密，更有可能是重要的活性物质。结果表明，这些成分可能是治疗阿尔茨海默病（AD）的潜在活性物质。 
 双变量相关分析（BCA） 双变量相关分析（BCA）的目的是检验两个变量之间的线性关联。皮尔逊相关系数用于衡量成分与药物疗效之间的相关程度。该系数的绝对值越高，表明相关性越强。本研究中使用的数据既可靠又具有代表性。在本研究中，利用SPSS统计软件（IBM，美国）中的BCA工具，评估了色谱峰面积值与表现指数（PI）之间的相关性。如图5所示，成分m、g、h、j、l、o、b、i、n、k、d、e和p与认知改善效果呈正相关，可能是治疗AD的潜在活性成分。 
 偏最小二乘回归分析（PLSR） 为了研究峰面积对果蝇PI的综合影响，使用SIMCA-14.1软件进行了偏最小二乘回归（PLSR）分析。如图6A和B所示，在该模型中，当R²和Q²均大于0.5时，表明模型不仅拟合数据良好，而且在预测新数据方面具有一定的准确性，显示出良好的泛化能力。因此，该模型被认为是拟合良好的。以VIP值大于1作为筛选潜在活性成分的标准，当VIP值超过1时，表明该化学成分对模型的贡献显著。此外，进行了200次置换检验。Q²回归线与y轴的交点位于负半轴，表明模型未过度拟合，模型验证结果有效（见图6C）。结果显示，成分o、l和j的VIP值均大于1，表明这三种成分与认知障碍的改善相关。因此，这些成分可能是KXS治疗AD的潜在活性成分。 
     

图5. 开心散HPLC指纹图谱中17个常见峰的峰面积与性能指标的相关系数   
    

图6. 开心散HPLC指纹图谱中17个常见峰的峰面积与性能指标的PLSR分析    
 
 8. 成分验证       基于上述谱效关系分析的结果，b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o和p可能是KXS的潜在活性成分。其中，选择了七种已鉴定的成分进行后续验证，进一步分析单一成分对Aβ42转基因果蝇PI的影响。如图7所示，15批KXS的PI值平均比MA提高了35%。然而，远志黄酮III、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、β-细辛醚和α-细辛醚的PI分别提高了30.26%、31.60%、27.36%、28.55%和30.74%。与KXS相比，这些活性成分的PI增长率在不同程度上有所下降。 

     图7. 经鉴定的开心散7种成分对Aβ42转基因果蝇性能指标的影响     
 
   结论              本研究成功建立了开心散（KXS）的指纹方法，该方法展现了精确性、稳定性和重现性。同时，确定了KXS中发挥抗阿尔茨海默病（AD）作用的关键活性成分：远志黄酮III、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、β-细辛醚和α-细辛醚。作为中医经典方剂，KXS具有重要的研究潜力，前提是对其质量进行全面监测和有效控制。一方面，基于AD的病理机制，建议进一步研究KXS的抗AD机制，为其临床应用提供理论依据。另一方面，可以将KXS的活性成分结合起来，开发用于治疗AD的新药。 
 
  在该研究中，研究人员使用了赛昂斯果蝇嗅觉训练装置（Sansbio，型号SA639）来进行实验操作。 
       

      果蝇嗅觉训练装置是一种用于研究果蝇学习和记忆能力的实验设备，特别是通过气味刺激结合奖励或惩罚来评估果蝇的行为反应。这些装置通常采用T型迷宫设计，并且能够提供不同类型的感官刺激，包括视觉和嗅觉线索。