三箱社交箱 | 自闭症谱系障碍小鼠中的性别偏向性单细胞遗传图谱

作者首先检测了产前暴露于VPA的小鼠是否表现出类似自闭症的社会交往障碍，并通过三箱社交实验得到了验证（图1B-E）。作者接下来检测了四只生理盐水处理（两只雄性和两只雌性）和四只产前接受VPA处理（两只雄性和两只雌性）小鼠海马体的转录谱（图1A），发现ECs和OLGs占大多数（图1F）。此外，评估了对照组和产前VPA暴露组中每种细胞类型的丰度。结果表明，在两组间除了OLGs之外，大多数细胞类型的比例是相似的。观察到的细胞类型比例的变化表明OLGs参与了ASD的调节（图1L-K）。并且，作者验证了以上发现与之前研究的单核RNA测序结果是一致的。

尽管ASD的患病率存在男性倾向，但尚未提出一种机制来明确解释这种性别差异，特别是在单细胞水平上。因此，为了更全面地理解这种性别差异的生物学基础，作者分析了产前VPA处理后雄性和雌性小鼠中每种细胞类型的数量（图2A），并进一步证明VPA处理对不同细胞群的影响（图2B）。这些结果表明，ECs和OLGs参与了自闭症性别选择性的调节，且在ASD的诊断和治疗中应考虑性别差异对药物敏感性的反应。

为了进一步评估性别与自闭症之间的关系，作者研究了产前注射VPA后海马体中的转录变化。根据细胞类型分析了雄性和雌性之间的DEGs（图2C），在两性神经元中大多数DEGs的富集程度相似，在两性产前VPA处理后许多基因参与突触传递途径或突触生成，且基因以性别偏向的方式差异表达（图2E-F）。

与神经元类似，脉络丛上皮细胞（CPECs）只占总检测细胞的2.5%。然而，作者观察到雌性中CPEC DEGs的数量是雄性的两倍以上（图3A）。与神经元不同，CPECs只共享了少数的DEGs（图3B）。KEGG分析的结果表明在VPA自闭症小鼠模型中炎症反应发生了变化（图3C）。

已有研究发现，ASD动物模型或产前VPA暴露后，脑组织中小胶质细胞突触形成异常，这表明在ASD中免疫功能障碍和突触功能障碍存在关系。为了验证这一点，作者在单细胞水平上探索了产前VPA暴露后雄性和雌性小胶质细胞的功能。结果表明，与对照组相比，VPA处理组在两性中小胶质细胞更为活跃（图4B和4C），许多基因参与了与炎症调节相关的途径（图4D）。这些发现暗示小胶质细胞在ASD中扮演关键角色，并且表明它们的抑制是一种有望的治疗方法。

总之，上述证据为小胶质细胞可以调和突触形成和免疫途径的变化提供了有力支持，表明在ASD的发病机制中小胶质细胞发挥关键作用。最后，结果表明，产前暴露于VPA会表现出夸大或异常的小胶质细胞炎症反应和异常的突触修剪。

作者通过单细胞RNA测序区分共有的和细胞类型特异性的基因。最常见的ASD上调基因是Ttr和Plp1。结果表明，Ttr在海马体的几乎所有细胞中都上调，且没有性别差异（图4E）。因此，作者认为Ttr是ASD的关键调节器。然后，作者调查了产前VPA暴露后海马体中细胞类型特异性基因的表达。结果揭示了一些细胞类型特异性标记物在产前VPA暴露后的表达发生了变化（图4F）。鉴于ASD患病率中明显的雄性倾向，作者推测小胶质细胞在ASD的发病机制中扮演中心角色。

为了进一步阐明细胞类型每个亚群的角色和差异，作者通过研究不同亚群之间的DEGs（图5A-F），分析了VPA暴露后每个亚群的变化。结果表明，在生理盐水组中除了C16亚群外，DEGs很少，但在VPA暴露组中有很多DEGs。Y以上结果表明，VPA（而不是性别）诱导了ASD的发病机制，并且雄性和雌性小鼠对VPA的反应不同。

为了进一步识别与ASD相关的DEGs和亚群，作者将所有亚群的DEGs映射到西蒙斯基金会自闭症研究倡议（SFARI）数据库。其中，C12包含了SFARI数据库中最多的DEGs。作者详细分类这些基因，以进一步探索它们在雄性和雌性小鼠之间的功能差异（图6A）。结果表明，C12中的大多数DEGs是雄性特有的，包括Gap43，并证实Gap43在雄性小鼠产前VPA暴露后上调（图6B），Cdh8在雄性小鼠产前VPA暴露后急剧下降（图6C），Gria3在雄性ASD小鼠中显著下调（图6D）。此外，作者在雄性特异的DEGs中发现了几个与智力障碍相关的X染色体基因，其中Bex3在雄性小鼠产前VPA暴露后显著增加，表明了其在ASD中的关键作用（图6E）。

作者进一步通过应用单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）算法分析了转录因子（TF）调控网络，该算法基于重建的基因调控网络活动来识别细胞状态。首先，作者比较了男性和女性在VPA暴露后的SCENIC结果。结果在男性中识别出13个调控子，在女性中识别出24个调控子，每个调控子代表一个TF，以及一组共表达和基序富集的靶基因。

为了进一步研究雄性和雌性海马体细胞间的联系，作者分别可视化了雌性和雄性中前10个聚体中最常见的配体及其在第12聚体中的相应受体的平均表达水平。在雌性中，神经营养因子Psap和孤G蛋白偶联受体37（Gpr37）在十个聚体中显示出最高的表达。Gpr37已被涉及在ASD中，并且表达在神经元和胶质细胞中。出乎意料的是，只有在雄性中检测到一个配体-受体对相互作用，即Gdf9-Fxyd6。