TissueFAXS Cytometry技术：SOX2 +细胞密度对结直肠癌患者预后和预测价值评估

结直肠癌（Colorectal cancer ，CRC）是最常见的癌症之一，国际癌症研究机构2018年的数据显示全球CRC每年约有180万的新增病例，90万的死亡病例。结直肠癌已经成为第三大恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的第二大原因。

组织病理学对指导治疗方案和预测预后有着关键性的作用。通常大多数I期患者可以手术切除治愈，而III期患者则需要采取辅助化疗以改善预后。部分预后标记物可用来识别具有高复发风险且需要后续治疗的II期患者。但是，化疗后的长期效果仍存在很大差异。所以，需要加入其他生物标记物来判定化疗有效性。

癌症干细胞（CSC）存在肿瘤组织中的细胞亚群里，通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力。SOX2（sex-determining region-Y homeobox-2）是在胚胎发育过程中至关重要的转录因子，用于维持多潜能性的干细胞。已有研究表明SOX2可作为CSC的标记物，并且能够逃脱免疫识别形成转移微环境造成致癌性增强。

西澳大利亚医学院的Platell教授团队早期对一组III期结肠癌患者的研究表明，结果显示高SOX2 +细胞密度与不良预后相关。但是，其中大多数患者已经接受了辅助化疗，因此无法客观评估SOX2的预后效果与其作为对化疗无反应的预测指标。本次实验是评估SOX2能否作为真正的结直肠癌预后的指标还是仅仅化疗反应的指标。

SOX2染色TMA样本来自797个II期和III期结直肠癌患者，其中大部分未接受过化疗。利用StrataQuest图像分析软件（TissueGnostics）对SOX2 +细胞密度进行定量分析；使用Kaplan–Meier估计和Cox评估总体生存期。发现高SOX2 +细胞密度与较差的总体存活率无关。而且，所有患者在接受5-氟尿嘧啶（5-FU）治疗后生存率均得到显着改善。因此，SOX2 +的细胞密度与预后或化疗获益无关。

本次实验结论与早期的研究相反，早期研究中，除5-FU外，大多数患者还接受奥沙利铂治疗。这表明SOX2可以预测对奥沙利铂治疗的反应，但不能预测5-FU。

该文章发表在Cancers上。

实验方法

TMA组织芯片制备和SOX2染色样本的定量分析方法是本次实验的关键。

SOX2是异质性表达标记物，利用TMA技术可能会增加假阴性的可能，高表达的患者数量增多。这是TMA的普遍局限性。关于数字图像分析，之前的研究中，使用其他软件量化分析SOX2，实验结果显示18％患有高密度SOX2 +细胞肿瘤。而在本研究中，使用StrataQuest软件只有10％。StrataQuest软件通过调节散点图的cut-off线可以消除由于背景染色或组织碎片产生假阳性信号。

使用StrataQuest软件进行SOX2阳性细胞识别和量化分析的工作流：

首先利用StrataQuest软件一键拆色功能自动识别出SOX2-DAB（棕色）与苏木素（蓝色）染色通道，并生成灰度图，便于后续查看各通道拆色情况。而后由于SOX2表达定位于细胞核中，我们可以利用DAB通道的灰度图进行核识别，以下是识别并利用紫色圈出的在DAB（棕色）通道（A）和原始彩色图像（B）上的SOX2细胞。

然后对识别到细胞进行量化分析，包括细胞核面积、苏木素及DAB染色强度等参数，以上数据均可自动生成二维散点图，且散点图中的每个点与所需的有效细胞对应。

图1. SOX2染色组织样本图像及定量分析

(A) SOX2低表达样本 (B)SOX2高表达样本 (C)SOX2高表达样本StrataQuest软件分析图像

SOX2染色主要集中在癌细胞的细胞核（图1）。II期的36例患者（8.1％）和III期疾病的44例患者（12.5％）被认为具有较高的SOX2 +细胞密度（表1）。未发现高SOX2表达与临床病理变量之间存在显着相关性。

图 2 StrataQuest软件自动组织区域识别

（A）SOX2低密度组织样本（B）SOX2高密度组织样本（C）组织区域识别结果

图3 SOX2阳性细胞识别和量化分析示意图

图中为DAB染色强度（X轴）与苏木素染色强度(Y轴)的散点图，利用样本数据信息，GATE设门圈选出SOX2阳性细胞群（C），并利用正反向回溯功能验证该细胞群分析结果，确保准确性，避免假阴性的出现。散点图中红色圈选代表SOX2+细胞，绿色圈选代表SOX2-细胞（C）。样本原图中识别并红色圈出的SOX2+细胞及绿色圈出的SOX2-细胞（D）。