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实时荧光定量PCR的实验步骤

893 人阅读发布时间:2021-08-13 09:22

 qRT-PCR,是Quantitative Real-time PCR 的简称,也叫实时荧光定量PCR,是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物的总量,通过内参或者外参法对待测样品中特定DNA序列进行定量分析的方法。

  qRT-PCR目前已成为不同样本间进行基因表达水平差异比较权威的方法。然而不适当的实验设计,没有足够的对照和重复,低质量的RNA样本,逆转录引物选择不理想,qRT-PCR的引物退火温度选择不当和数据分析方法不正确等都可能会成为影响qRT-PCR检测灵敏度的因素。


1.实验设计
由于RNA易降解,对外在环境敏感,因此在实验条件或样本操作等各个环节都需要严格把控。


2.RNA抽提
  RNA的抽提环境非常关键(近朱者赤,近墨者黑)。由于RNA酶无处不在和其难以灭活的顽固本性(敌人总是很强大),在实验的每一步,任何偶然的疏忽或不妥当的操作都有可能造成RNA酶的污染,从而导致整个实验的失败(一着不慎,满盘皆输)。因此,严格控制实验条件,避免任何可能的污染,是保证实验成功的关键(出淤泥而不染的才是真君子)
  RNA抽提建议用专用的操作区,离心机、移液枪、试剂等均应专用;所用的耗材、溶液及试剂均应是RNase-free或经过DEPC处理过的(这一步很费精力但不得不做,所以失败了会很痛苦)
  操作过程中应始终戴一次性橡胶手套,并经常更换,以防手臂上的细菌、真菌以及人体自身分泌的RNA酶造成污染(要是夏天手掌出汗,会更痛苦,但还是不得不做)
  避免在操作中说话聊天并且要记得戴口罩以防RNA酶污染;(不要问我可以戴着口罩说话不这种自相矛盾的问题好吗?)
  提取过程应尽量保持低温环境(所以戴个手套是正确的选择)并减少操作时间(长痛不如短痛啊)
  如果样本在采集后不能立即处理,则需要把样本保存于-80℃(样本直接冻存或保存于Trizol中)。
  Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,可以直接从细胞或组织中提取总RNA。苯酚的主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase(RNA酶)。
  为缩短RNA抽提的操作时间,建议以10-20个样本的小批次来处理样本。
  无论是Trizol 手提RNA还是使用试剂盒抽提RNA都应包括DNaseI处理步骤以便去除基因组DNA污染。


3.RNA质量控制
  在qRT-PCR中使用高纯度(无污染)和高完整性(无降解)的RNA是最基本的要求。
  不纯的RNA样品会抑制PCR反应,产生偏离的数据。使用部分降解的RNA会产生可变和不正确的定量结果。
  因此RNA样品的纯度和完整性是进行下游实验的最基本要求。


 


 
资料格式:

实时荧光定量PCR的实验步骤.pdf

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