质粒抽提—实验室必备技能之一
150 人阅读发布时间:2021-08-12 17:31
质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中,是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶(主要针对革兰氏阳性细菌)可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和 TritonX-100(一般很少使用)可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后, 细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,简称cccDNA)的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法,它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。当然,碱裂解法也有缺陷:容易导致不可逆的变性。要降低不可逆的变性,就要控制好碱裂解的时间。
碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液:
溶液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0),10 mmol/L EDTA(pH 8.0),在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min,4℃保存。
溶液Ⅱ
0.2 mmol/L NaOH(从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释),10 g/L SDS(室温保存)。
溶液Ⅲ
5 mol/L乙酸钾 60.0 mL,冰乙酸 11.5 mL,无菌水28.5 mL, 4℃保存,使用时置于冰浴中。
下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作: