应用案例 | Protein Maker高通量全自动蛋白纯化仪

Protein Maker^TM高通量全自动蛋白纯化仪可以通过平行纯化加速您的蛋白功能研究。它具有24个平行纯化柱（1-5 ml），并且可以全自动处理96个样本， Protein Maker^TM主要具有的三大操作模式（生产模式、侦测模式、复合模式）以灵活的设计使其可以适用于多个应用场景。接下来，让我们一起来了解一下吧。

1 生产模式

1.1 抗体生产或筛选——工程抗体的纯化

Had是针对病毒抗原靶标的完全人源化抗体，对野生型靶标具有高亲和力，而对流行的自然变异株不具有亲和力；实验的目标是提高该抗体对变异株的亲和力而不丧失对野生型靶标的亲和力。实验使用1ML的HiTtrap蛋白A柱对24个突变体（在CHO细胞中表达）各纯化50 ml。产量为2-10 mg，纯化结果可以为生物物理特性分析（例如SEC/LS、 SDS-PAGE和DSC等分析）以及亲和力测定提供足够的材料。

图 1 突变体13-24的非还原性和还原性SDS-PAGE结果

图 2 突变体1、22和24的SCE液相色谱分析结果图

1.2 多个结构的生产和纯化

1.2.1 多结构设计和纯化

Protein Maker^TM高通量全自动蛋白纯化仪平行处理可实现多个构建体（内部缺失突变体）的规模化纯化并且获得具有可以高度结晶化的结构。实验利用大肠杆菌优化表达基因，表达产量可达到每升细胞培养物表达0.1-15 mg。

图 3 分别加裂解液和洗脱液的电泳结果

图 4 结晶化电镜图

1.2.2 激酶X-17构建体的生产

图 5 平行镍柱亲和纯化（4次洗脱）

图 6   9个结构去除His标签，并用于晶体筛选

1.3 不同裂解液平行测试

细胞色素P450（CYP51A1）不溶于标准裂解缓冲液，通过改变裂解缓冲液条件使其可溶，Protein Maker^TM除了是高通量纯化的有效手段，还可以是快速测试多种蛋白质靶细胞裂解条件的宝贵工具，实验测试了12种不同的裂解缓冲液条件，探索细胞色素P450作为靶细胞可溶的特定条件。

表格 1 细胞色素P450的细胞裂解缓冲液测试条件表

图 7   CYP51A1的12种不同细胞裂解缓冲液条件下的SDS-PAGE分析。红框带表示亲和层析后两种产生最佳产率的细胞裂解液条件下的检测结果。

1.4 通过并行化实现无风险规模化

6×5 ml柱床平行纯化，利用Protein Maker^TM无需传统的放大纯化步骤，只需四步可以将目标蛋白从20 mg纯化到远大于100 mg，可以通过开发5×放大方案，重复5-6×初始纯化或者平行做各种模式小规模纯化。

图 8 四步层析结果图：①Ni-亲和层析；②融合蛋白分离；③2ndNi-亲和层析；④大小排除层析

2 侦测模式——不同树脂平行测试

侦测不同的树脂（最多24个）以优化一种蛋白质。

图 9 利用不同树脂的层析结果图

3 复合模式

3.1 多柱纯化

图 10 自动双柱纯化图

3.2 两步纯化

利用Ni柱和Protein A柱对Fab进行2步纯化。Ni纯化的His-tagged Fabs需要额外做纯化，尤其是对低产率蛋白，2步纯化普遍产率较高，Ni纯化后需要利用缓冲液进行交换，而Protein A被串联添加后可以提高纯度并且不需要再进行缓冲液的交换。

图 11 不同条件下电泳结果图：①通道表示无细胞提取物；②通道表示Ni纯化；③通道表示Ni和Protein A纯化

Protein Maker^TM除了具有以上这些场景的应用优势外，配置的软件系统也非常方便快捷，可定制化纯化方案，并且提供实时的纯化状态信息，您可以通过软件随时暂停任何过程，纯化结束，软件还可以帮助分析和共享结果。结合以上优点，相信，Protein Maker^TM一定可以助力您的蛋白纯化相关研究。