N家干货 | CCK-8在药物研发中的实验技巧

1.CCK-8实验

在生物学活性研究中，CCK-8（Cell Counting Kit-8）因其操作简便，灵敏度高，无放射性污染等优点，是一种常用的细胞增殖和细胞毒性检测方法。CCK-8试剂中的WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐）在细胞脱氢酶的作用下被还原生成一种水溶性的橙色甲瓒染料，其生成量与活细胞的数量成正比。因此，理论上通过测量吸光度（OD值）可以准确反映细胞的数量和活性。

在进行CCK-8实验时，研究人员通常将细胞接种于96孔板中，加入不同浓度的待测物质后，孵育一定时间，再加入CCK-8试剂进行显色反应。通过酶标仪测定450nm处的吸光度（OD值），可以定量分析细胞的增殖和存活情况。CCK-8实验不仅能够快速、准确地评估细胞的增殖和活力，还能为药物研发和细胞生物学研究提供重要的数据支持。

2.实验情况及解决方案

然而，在实际操作中，研究人员可能会遇CCK-8实验中出现镜下趋势正确但OD值不对的情况，可能由多种因素引起。以下是一些常见原因及其解决方法：

（1）细胞接种不均匀

✦原因：细胞悬液混匀不充分或接种手法不当，导致细胞在孔板中的分布不均匀。

✔解决方法：确保细胞悬液充分混匀，使用移液枪斜贴孔板壁加样，控制加样速度和量。

（2）暴力加药

✦原因：加药过程中操作过于剧烈，导致细胞机械性损伤。

✔解决方法：使用适当的移液器，缓慢均匀地加入药物，避免产生气泡和药物溅出。

（3）液体蒸发

✦原因：边缘孔液体蒸发速度快，导致细胞生长环境差异。

✔解决方法：在孔板外侧两排加入培养基或缓冲液，减少培养时间。

（4）检测前未摇匀

✦原因：孔内液体未充分混匀，导致甲瓒产物浓度不一致。

✔解决方法：在加入CCK-8试剂并孵育后，轻轻晃动或敲击孔板，确保液体充分混匀。

（5）药物干扰

✦原因：某些药物具有还原性或氧化性，影响CCK-8显色反应。

✔解决方法：在加入CCK-8之前更换新鲜培养基，去除药物影响。

（6）孵育时间过长

✦原因：孵育时间过长导致甲瓒产物饱和，OD值变化不明显。

✔解决方法：通过预实验确定最佳孵育时间，避免颜色饱和。

3.影响CCK-8结果的因素

影响CCK8结果的因素有很多，其中最关键的因素之一是细胞状态。细胞状态的优劣直接影响着实验结果的准确性，如果细胞状态较差，即使进行了处理也可能导致细胞增殖缓慢甚至细胞死亡，使得结果产生误差。

另外，细胞状态和实验操作的成功与否是影响CCK8结果准确性的关键因素之一。在实验过程中，如果细胞转染失败或处理不当，可能会导致对照组和实验组的OD值结果相近，无法得出明显的差异性结果。

其他还有比如：

①细胞数量：每孔接种的细胞数量对结果有直接影响。对于贴壁细胞，建议每孔至少接种1,000个细胞，而对于白细胞，建议接种量不低于2,500个。

②培养时间：加入CCK-8后的培养时间会影响吸光度值。如果吸光度值过高，可以缩短培养时间；如果吸光度值过低，可以延长培养时间。

③培养基成分：培养基中的酚红不会影响检测结果，因为可以通过扣除空白孔中的本底吸光值来消除影响。

④药物干扰：某些药物可能会与CCK-8试剂发生反应，影响吸光度值。可以在加入CCK-8之前更换培养基以去除药物的影响。

⑤细胞状态：细胞的代谢水平和健康状态也会影响CCK-8的结果。即使细胞数量相同，如果细胞代谢率低，产生的Formazan也会减少。

⑥试剂批次：不同批次的CCK-8试剂可能会有轻微的灵敏度差异，建议每次实验都做标准曲线。

⑦温度和光照：CCK-8试剂需要避光保存，且在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。

⑧细胞类型：不同类型的细胞对CCK-8的反应不同。悬浮细胞通常需要更多的细胞数量和更长的培养时间。

这些因素都会影响CCK-8实验的结果，因此在实验设计和操作过程中需要仔细控制和优化这些变量。

4.NovoBio自研CCK-8试剂盒

NovoBio自研试剂CCK-8，每一批都有严格的质量管理体系和COA证书，确保试剂的批间稳定性，同时在0.1~4.5万个/孔的细胞密度范围内具有很好的线性（R2 >0.99）和进口品牌DOJINDO的对比实验显示灵敏度和检测时间均优于竞品。

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