N家干货 | 聊聊MDA5及其活性细胞株

1.背景介绍

黑色素瘤分化相关基因5（Melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）是一种关键的抗病毒免疫反应基因，能识别小核糖核酸病毒RNA并介导免疫激活，促进病毒感染细胞的凋亡。在黑色素瘤分化中，MDA5的作用机制主要 表现在抗病毒作用、信号转导和自身抑制结构域。了解MDA5在黑色素瘤分化中的作用机制有助于深入探讨黑色素瘤的发病机制和寻找潜在的治疗靶点。

2.MDA5与抗MDA5

MDA5，是视黄酸诱导基因-I（RIG-I）家族的成员。当MDA5被激活后，它会与线粒体外膜上的适配体线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）结合，进而通过肿瘤坏死因子受体相关因子3（TRAF3）和TANK结合激酶1（TBK1）激活干扰素调节家族3（IRF3）。这些过程最终诱导产生大量的I型干扰素（IFNs），展现出强大的抗病毒特性。

2005年，抗MDA5抗体首次在日本的临床肌病性皮肌炎（CADM）患者群体中被发现。随后研究表明，MDA5是自身免疫抗原的靶点，该抗原由干扰素诱导的含螺旋酶C结构域蛋白1（IFIH1）基因编码。抗MDA5抗体，又称为抗CADM-140抗体，是一种140kDa的多肽，最初由日本学者Sato等2005年通过免疫沉淀法在CADM相关间质性肺病（ILD）患者的血清中发现。2009年，Sato等通过cDNA文库筛选的方法确认MDA5基因编码的胞质RNA解螺旋酶是抗CADM-140抗体的靶抗原。

3.IFNs

IFNs是一类具有显著抗病毒特性的多肽，最早在60多年前被发现。除了抗病毒作用外，I型IFNs在炎症、癌症和自身免疫疾病中也发挥着重要作用。I型IFN系统包括I型IFN本身以及其诱导剂、细胞和其他参与其生成及功能的分子。人体内主要有IFNα和IFNβ，其中IFNα主要由质体树突状细胞（pDCs）产生，而IFNβ几乎在所有有核细胞中都能生成。

I型IFN的产生可以依赖或不依赖类毒素受体（TLR），取决于诱导剂的性质。TLR3、TLR7、TLR8和TLR9是最主要的TLR，在许多先天免疫细胞中表达，其中TLR7和TLR9主要在pDCs的内体膜上表达。除了直接抗病毒特性外，I型IFN还能增强自然杀伤细胞（NK）的细胞毒性、巨噬细胞的细胞内杀伤作用，刺激树突状细胞（DCs）成熟为有效的抗原递呈细胞（APC），并提高I类和II类主要组织相容性复合体（MHC）的表达，进一步增强先天和适应性免疫反应。

在IFNα/β的刺激下，成熟的DCs会表达协同刺激分子（如CD80和CD86），产生趋化因子（如CXCL9和CXCL10）及细胞因子（如IL-15），从而增强抗病毒免疫反应。I型IFN还促进了T细胞和B细胞的效应功能，促进免疫球蛋白（Ig）的转换和抗体的产生，并增加记忆细胞的生成。

4.皮肌炎（DM）

皮肌炎（Dermatomyositis，DM）是一种特发性炎症性肌病（IIM），以慢性全身性炎症为特点，主要影响骨骼肌、皮肤、关节和肺部。根据肌炎特异性自身抗体的不同，DM有几种高度异质性的表现形式。其中，抗MDA5抗体阳性的患者通常会出现典型的皮肤病变，但肌肉受累的程度较轻，有时甚至没有肌肉受累。然而，这类患者面临较高的风险发展为快速进展性间质性肺病（RP-ILD），这种疾病通常伴有高死亡率。研究显示，与抗黑色素瘤分化相关基因5抗体阳性皮肌炎（MDA5+ DM）相关的 RP-ILD 在第一年的死亡率为34.8% - 80%。

5.信号通路

图1. IFN I 介导的 MDA5+ DM 的细胞病理学

在具有易感基因背景的个体中，未知病毒触发的dsRNA会被MDA5感知，导致浆细胞样树突细胞（pDCs）异常产生IFN。I型IFN可增强树突状细胞（DC）的抗原呈递、T细胞和B细胞的效应功能以及浆细胞的抗体生成。抗MDA5抗体会大量生成，然后识别MDA5，形成含RNA的免疫复合物（IC）。ICs可通过（Toll样受体7）TLR7激活I型FN的产生。所有这些都会促进I型IFN的持续产生，从而通过一个具有恶性循环特征的过程来维持发病机制。此外，单核细胞和巨噬细胞也可能会导致（快速进展型间质性肺炎）RP-ILD的发生。

6.NovoBio相关活性检测细胞株

✦ 构建原理

HEK293-MDA5-Luc 的细胞表达MDA5，下游具有报告基因Luciferase。当dsRNA与细胞内的MDA5结合后，通过细胞内的信号转导诱导下游反应元件激活从而促进Luciferase信号的表 达，该信号值高低和dsRNA浓度成正比，形成剂量依赖型曲线。

图2. 报告基因法检测dsRNA的作用机制MOA图

✦ 数据展示

（1）单克隆细胞株活性曲线验证

使用Poly(I:C)对 HEK293-MDA5-Luc细胞株进行活性曲线检测，该细胞株对Poly(I:C)有明显的 浓度响应效应，曲线拟合度较好。其结果分别如下图。

图3. Poly(I:C)刺激 HEK293-MDA5-Luc细胞株活性曲线验证结果

（2）优势特点

✅方法稳定，变动小；

✅实验窗口大，响应值高；

✅利用转基因构建的效应细胞可稳定传代；

✅适合放行、长期稳定性检测，方便方法验证。

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