N家干货 | 聊聊细胞实验的“烦人精”--支原体

1.关于支原体

又称霉型体，大小为0.1-0.3μm，是介于细菌和病毒之间的一类无细胞壁、已知最小、可自我复制的原核生物。大部分支原体能够透过一般滤膜（0.22μm），有多种形态，不能被革兰氏染色，可在琼脂固体平板上形成典型的“荷包蛋”状菌落，能被甲基蓝染色。

✦ 生存方式

支原体基因组大小约为500-2000kb，有环状双链 DNA，基因组A-T含量高（55％～80％），编码基因约500个。但支原体不能够大量合成生长所需要的能量物质，必须从体外获取能源（如精氨酸、葡萄糖、尿素等）才能生存繁殖，这决定了支原体的生活方式——共生、胞内寄生或者独立生存。大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，最适pH值为7.8～8.0。

✦ 致病性

较弱，一般不侵入血液，但可通过黏附作用与宿主细胞结合，从细胞膜获取脂质，使细胞膜损伤。溶脲脲原体可分解尿素放出大量的氨，毒害细胞。研究表明，支原体感染会影响细胞脂类代谢通路中关键酶的分泌、上调黑色素瘤细胞的细胞凋亡，致瘤性和侵袭性、诱导肺上皮细胞产生炎症因子，以及诱导神经元细胞的氧化应激等。

✦ 污染&清除

细胞受支原体污染程度较轻时，无明显的症状，但一旦爆发，细胞会大量脱落，细胞培养液会变浑浊。原代和传代细胞都可能遭受支原体污染，根据国外不同实验室的调查结果显示，有相当数量的实验细胞被支原体污染过，传代细胞的污染率高于原代细胞。

支原体对热、干燥敏感，对75%乙醇、煤酚皂溶液、红霉素、四环素、螺旋霉素、链霉素、卡那霉素等敏感，但对青霉素类的抗生素不敏感。45℃，30 分钟或60℃，10分钟加热即可灭活支原体。由于各种类的支原体具有的表面抗原差异很大，尚未找到通用的表面抗原，故不能依靠非特异性的抗体来杀死各个种类的支原体。

细胞受支原体污染后，功能和活性都会受到影响，会带来不可靠的实验结果和不安全的细胞制品，因此对细胞进行支原体检测十分关键。

2.检测方法

（1）琼脂-肉汤培养法

检测样本直接接种到琼脂平板以及液体培养基（如肉汤培养基）中，观察支原体生长情况，总检测时间为28天。

（2）指示细胞法

有些特殊的支原体菌株无法在标准培养基中生长，可考虑将Vero或NIH3T3细胞的培养物培养支原体。孵育一周后，将细胞固定，用DNA结合荧光染料染色，并在显微镜下进行评估细胞表面和周围区域是否出现明亮荧光。

（3）qPCR法

• 特异性核酸扩增及荧光探针技术：可分析检测支原体特定核酸序列的存在，但不一定表明存在活支原体。
• 肉汤培养基生长富集和RT-PCR：包括核酸检测前的生长富集步骤，样本在第0天和第7天进行检测。
• 细胞共培养生长富集和RT-PCR：包括核酸检测前的生长富集步骤，样本在第0天和第5天从细胞共培养中进行检测。

（4）相差显微镜检测

将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察。支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。

（5）电镜检查

用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。

✦ 注意事项

虽然PCR法具有快速、灵敏和广谱性强等优点，但监管机构并未普遍批准并采纳。并指出在特定情况下，可以和传统方法进行可比性研究，证明方法的等效性后，再作为补充方法。

✦ PCR法的局限性：

（1）支原体与衣原体具有一定的同源性，PCR出现假阳性结果；

（2）细胞培养几天后，培养液中会产生严重抑制PCR扩增的代谢物，样品前处理的效率至关重要；

（3）灵敏度有限，通常需要将培养液离心浓缩或者提取DNA后检测。

3.相关法规

目前，FDA、WHO等不同国家和地区监管机构和中国药典、欧洲药典、美国药典和日本药典中都明确要求对可能受支原体污染的生物制品生产过程中的原材料、生产过程的关键节点与生物制剂进行支原体检测。

•中国药典2020版三部：生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制

•中国药典2020版三部：3301 支原体检查法

•欧洲药典 2.6.7：Mycoplasmas

•美国药典 <63>：Mycoplasma Tests•ICH Q5D: 用于生产生物技术/生物产品的细胞底物的起源和特征描述

•CBER/FDA, Points to consider in the characterization of cell lines used to produce biologicals (1993)

•CBER/FDA, Points to consider in the manufacturing and testing of monoclonal antibody products for human use (1997)

•FDA, Guidance for Industry :Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications（2010 年 2 月）   

✦ 详解版

（1）美国药典＜USP＞63中指出需要用两种方法检测支原体污染：

（A）琼脂－肉汤培养法 和（B）指示细胞法。并提出经验证的核酸扩增方法（NAT）或酶学方法可以用于检测支原体，但前提是该方法经验证可与培养法和指示细胞法等效。

（2） 欧洲药典EP2.6.7中也要求如USP，并且更详细的介绍了NAT方法代替前1或2种方法的具体验证要求。直接NAT法可以在有细胞毒性的材料中应用或需要快速方法时使用。细胞培养富集后NAT方法适合于待检样品与指示细胞共培养一段时间后，从细胞和上清中提取核酸，再通过NAT检测。

（3）中国药典3301也指出主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体；必要时，亦可釆用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。

需检测产品清单：

•生物源性材料：如猪胰酶、牛血清等（如作为生物制品生产用原材料）

•生产及检定用细胞库：MCB\WCB\EOPC

•抗体上清收获液UPB

•病毒类疫苗的病毒收获液、原液

•临床治疗用细胞

•其他可能受支原体污染的材料、样品等

4.防控方法，重在防止

（1）添加抗生素

在使用抗生素前需进行药敏试验，筛选出合适的抗生素种类和剂量后再添加。

（2）及时消毒灭菌：

生产过程中使用的一切物品均需要进行彻底的清洗与消毒处理，同时对使用的各种溶液进行严格的高压灭菌处理，确保在进行无菌试验检测结果呈阴性后再使用。对操作室和剩余的耗材等均需要进行定期的清洁、消毒及灭菌。

（3）规范操作：

工作人员在进入无菌室前要严格按照疫苗生产GMP的要求使用洗手，并且按照相关规定穿戴无菌服和无菌帽。在生产工作开始前还需使用浓度为75%的酒精擦拭手、瓶口，同时对瓶口进行灼烧。其次，无菌室内的操作者要尽量减少走动，并且动作要轻。每次试验结束后都需要使用消毒剂擦拭操作台面。最后，在每次生产工作开始前对生产线进行臭氧消毒。

（4）定期检测：

严格执行生物制品相关的管理制度和操作规程是保证生物制品质量的核心要素。因此需要定期对相关物料、环境、中间品等进行支原体进行检测，如发现有被支原体污染的情况需及时对其灭活处理，避免造成更广泛的传播。