miRNA研究服务案例2：miR-95通过抑制SNX1基因增加结肠癌细胞的增殖

microRNA是一类约22个核苷酸长度的非编码RNA小分子，一般通过与mRNA的3‘UTR区域相互作用从而抑制 相关基因的表达。据研究表明，microRNAs在转录后水平上至少调控了三分之一的人类基因。目前最新的microRNA数据库（miRBase）版本 号是17.0（April 2011，www.mirbase.org），涵盖了153个物种、共19724条成熟microRNA序列。虽然microRNA的研究进展神速，但是大多数microRNAs在生理或病理过程中发挥作用的机制仍未被揭示出来。

结肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是世界第三大癌症，虽然在过去几十年中结肠癌的治疗技术取得了长足的进步，但是结肠癌的分子病理机制仍未被了解清楚。过去的 研究发现了一些蛋白编码基因（例如：P53，APC，K-ras，DCC等）可能与结肠癌的形成有关，但是在结肠癌形成过程中发挥作用的microRNA 却一直没有被发现。

在本文中，复旦大学附属肿瘤医院黄朝晖博士在导师杜祥教授和上海市肿瘤研究所癌基因和相关基因国家重点实验室何祥火研究 员指导下利用基因芯片高通量筛选的方法，找到了影响结肠癌增殖速度的microRNA——miR-95，并鉴定了miR-95的下游靶基因SNX1。该研 究成果发表在2011年3月的Cancer Research（影响因子8.234）上。基因芯片技术服务由上海伯豪生物技术有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心（www.ebioservice.com）完成。

 一、基因芯片高通量筛选发现miR-95与结肠癌细胞增殖有关

研究小组首先选取了10对结肠癌组织和癌旁组织，用microRNA芯片（Agilent microRNA microarray）进行分析，共发现49条有表达差异的microRNA。随后从中选取了几个microRNA用miRNA拟似物转染分析实验 （miRNA mimics transfection assay）分析它们对结肠癌细胞生长的影响，结果发现miR-95有最强的促进结肠癌细胞增殖的能力。而以往也有报道，在多种肿瘤（结肠癌、肺癌、胰腺 癌等）中能观察到miR-95的过表达。这样的结果表明，miR-95表达量的变化很有可能与细胞癌变过程有关。

慢病毒转导的方法，研究小组构建了稳定表达miR-95的HCT-116和LoVo细胞系（两种结肠癌细胞），通过细胞 增殖实验（cell proliferation assay）和克隆形成实验（colony formation assay）发现，miR-95表达上调可显著促进结肠癌细胞增殖。而用RNAi的方法降低miR-95的表达量则会降低结肠癌细胞的生长速度。将稳定转 染miR-95的LoVo细胞和稳定转染慢病毒空载体的LoVo细胞注射到裸鼠中观察肿瘤细胞的生长速度，结果也发现高表达miR-95的肿瘤细胞生长更 快。这样就从体外实验和体内实验两个方面证实miR-95能促进结肠癌细胞增殖。

综上，该研究小组通过microRNA芯片筛选到了在结肠癌中差异表达的49种microRNA，通过microRNA拟似物转染分析实验确定miR-95为初步的研究对象。随后通过一系列体内、体外实验证实，miR-95确实能促进结肠癌细胞的增殖。

图1：microRNA芯片结果聚类，共筛选得到49条有差异表达的基因

 二、miR-95通过作用于靶基因SNX1促进结肠癌细胞增殖

microRNA一般通过抑制下游基因来发挥作用，由于前面的研究结果表明miR-95促进肿瘤细胞的增殖，那么它所抑 制的下游基因应该是肿瘤抑制基因。研究小组用TargetScan预测了一些miR-95的靶基因，采用荧光素酶报告基因分析（luciferase reporter assay）发现， SNX1受miR-95抑制最为显著。而在SNX1的3‘UTR区域引入突变之后，SNX1就不被抑制了。Western实验也显示，在结肠癌细胞中过表 达miR-95，那么SNX1蛋白量降低；而抑制miR-95，SNX1蛋白含量则会升高。这些结果都表明：SNX1是miR-95的下游靶基因。

在结肠癌细胞中用siRNA抑制SNX1的表达能促进结肠癌细胞的增殖，这一现象和增加miR-95的表达量一致。而共 转染实验显示，在敲除了SNX1的细胞株中，再抑制miR-95的表达量，也不能使细胞增殖速度回到正常水平。而在miR-95高表达、细胞增殖速度很快 的细胞系中，增加SNX1的表达量则能使细胞增殖速度下降。这些现象表明，在结肠癌细胞中，miR-95通过抑制SNX1来促进细胞增殖。

综上所述，该研究利用microRNA芯片筛选得到了影响结肠癌增殖速度的microRNA——miR-95，并进一步阐明了miR-95在结肠癌中的功能和分子机制，提示microRNA在结肠癌中扮演癌基因角色。该研究对于结肠癌分子机制的进一步揭示和药物开发具有重 要意义。

原文出处：

Huang Z, Huang S, Wang Q, Liang L, Ni S, Wang L, Sheng W, He X, Du X. MicroRNA-95 promotes cell proliferation and targets sorting Nexin 1 in human colorectal carcinoma. Cancer Res. 2011, 71(7):2582-9. （影响因子8.234）

使用服务种类：Agilent miRNA芯片服务

编辑： hejianxin    来源：丁香园