miRNA研究服务案例1：毛白杨性别特异性花相关的miRNA及其靶基因
来自北京林业大学的张德强教授研究组的研究人员发表了题为“Sexual Dimorphism Floral MicroRNA Profiling and Target Gene Expression in Andromonoecious Poplar (Populustomentosa)” 的文章。该研究首次系统的考察了与毛白杨性别特异性花相关的miRNA以及它们的靶基因，加深了我们对miRNA在毛白杨雄花和雌花形成中所起的调控作用 的认识。研究者以雌雄同株异花的毛白杨作为研究对象，排除了雌雄异株异花植物不同的遗传背景的影响，并在此基础上，采用高通量测序、生物信息学分析、实时 定量PCR等方法，发现了白杨花中的27个miRNAs，它们的靶基因与花的形成、Ca2+转运、植物激素的合成与代谢以及DNA甲基化相关。文章发表于PLOS ONE杂志。
研究人员首先对毛白杨的雌花与雄花分别构建两个独立的文库，对sRNA进行测序，通过与miRBase19.0数据库比对，得到一些保守的miRNAs， 再将未知的sRNA与杨树基因组、miRBase19.0、NCBI Genebank以及Rfam数据库比对，发现仍有超过60%的未知sRNA。所有的sRNA长度大多数是21nt或者是24nt，在雌花中21nt的 sRNA最多，其次是24nt的，在雄花中这两种长度的sRNA数量没有显著性差异。
Small RNAs from female and male flower libraries in andromonoecious poplar.
(A) Distribution of unique sRNA annotation categories. (B) Size distribution of small RNA reads.
进一步研究保守的和新的miRNAs发现，在所有的保守的miRNAs中，miRNA6459仅在雌花中表达，miRNA397以及miRNA6462仅 在雄花中表达。在鉴别出的78个新的miRNAs中，仅有6个sRNAs是雌花与雄花共有的，61个sRNAs是雌花所特有的，11个sRNAs是雄花所 特有的。
Summary of common and specific sequences between
female and male libraries（Novel sRNAs）
据报道，染色体XIX是杨树初始的性染色体，围绕这条染色体，研究人员继续展开深入的探索，发现6个新的miRNAs就位于该染色体上，它们共有33个靶 基因，为了推断这些靶基因的功能，采用BLAST比对TAIR、NCBI、JGI蛋白数据库，发现这些靶基因与抗病性、植物对生长素的反应、DNA的去甲 基化以及膜转运相关。此外，早前已有文献指出在染色体XIX远端粒端2.45Mb的片段与性别决定相关，而本研究中Pto-70以及4个靶基因恰好在这个 性别决定区内。
Pto-miR156, Pto-miR159, Pto-miR172、Pto-miR319这4个miRNA与已知的杨树miRNA的靶基因不同，所以将它们的25个靶基因与新发现的78个 miRNAs的464个靶基因一并进行研究。根据生物过程将雌花与雄花特异性miRNA的靶基因进行分类，GO分析显示，这些靶基因主要与激素刺激反应、 基因表达下调、花发育调节、器官形成相关。
AgriGO analysis of target genes for statistically enriched GO terms in the ‘Biological process’ ontology. Coloring of GO term nodes is proportional to their significance as indicated by the scale.
本研究得出27个miRNAs（包括4个保守的和23个新的miRNAs）的表达在雌花与雄花中有显著性差异。根据基因富集的结果，将31个靶基因选作基 因表达分析，实时定量PCR检测miRNA的靶基因发现，靶基因的表达量与miRNA的水平呈负相关，这与miRNA的基因沉默功能相一致。
皮尔逊相关系数热图表示毛白杨花中miRNAs的表达以及它们的靶基因，红色和黄色代表高水平的转录，绿色和蓝色代表低水平的转录。A：保守的和新的miRNAs的热图，B：靶基因的热图。
本研究首次报道了与花发育相关的miRNAs以及它们的靶基因，根据基因注释，将所有的靶基因分为四类。第一类，花发育相关：Pto-F6, Pto-F11, Pto-F14, Pto-F19, Pto-25, Pto-36, Pto-F51, Pto-F54以及Pto-F66。第二类，Ca2+转运相关：Pto-F28 和 Pto-F45（雌花特异性miRNA），Pto-F16（雄花特异性miRNA）。第三类，激素调节相关：10个miRNAs（除Pto-F6以外均为雌花特异性）。第四类，与DNA甲基化相关：3个miRNAs。
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原文出处：
Song Y, Ma K, Ci D, Zhang Z, Zhang D (2013) Sexual Dimorphism Floral MicroRNA Profiling and Target Gene Expression in Andromonoecious Poplar (Populus tomentosa). PLoS ONE 8(5): e62681.
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