lncRNA的功能研究

与miRNA只含有二十多个核苷酸不同， lncRNA较长，承载的信息量多，更容易形成高级结构，因此，lncRNA的功能具有多样化和特异性强的特点。对其功能的探索也采取了多种方式。

类似于miRNA，探讨lncRNA功能可用 gain/loss of function 策略。过表达或沉默lncRNA后观察表型。在构建lncRNA表达质粒时，需关注lncRNA是否在蛋白编码基因的启动子区域或3’-UTR区域，勿遗漏重要区段； 也可用siRNA等方法沉默lncRNA，经qRT-PCR或FISH等验证后观察其对疾病相关基因表达和对细胞表型等的影响。实际上，对基因表达或细胞表型的观察也不是任意或无目标的。基于该lncRNA的GO分析等生物信息学手段有助于缩小观察范围。

近年来出现一种非编码RNA沉默与定位分析(Combined knockdown and localization analysis of noncoding RNAs, c-KLAN)技术，用于对lncRNA进行功能缺失研究和细胞定位。该技术针对目的lncRNA设计引物，将其逆转录成cDNA, PCR扩增cDNA， 此后，一方面对扩增产物进行体外转录, 生成dsRNA，用核糖核酸内切酶Ⅲ酶切dsRNA来制备esiRNA (endoribonuclease-prepared siRNA)，用于对lncRNA进行功能缺失研究；另一方面用荧光标记的UTP对扩增产物进行体外转录，以制备正义或反义的FISH探针，用于对lncRNA进行定位分析。

lncRNA可与蛋白质、DNA和RNA相互作用，实现多样化功能。因此，可通过与其互作的分子探讨其功能与作用机制。通过互作的蛋白质研究lncRNA的方法如RIP（RNA-immunoprecipatation）技术，包括化学交联RIP、nRIP(native RIP)和CLIP（UV-crosslinked immunoprecipatation）。它是通过特异的抗体结合核蛋白复合物捕获与lncRNA的。它可与新一代测序技术结合。RIP-Seq和CLIP-Seq(又称HITS-CLIP)可用于lncRNA筛选和功能研究。通过lncRNA与DNA相互作用的检测方法有ChIRP（Chromatin isolation by RNA purification）、CHART（capture hybridization of RNA target）和ChRIP（chromatin RNA immunoprecipatation）等。由于lncRNA可通过形成二级或三级结构行使功能， 可采用RNase footprinting，Chemical Mapping，in-line Probing和SHAPE（selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension）等技术研究其功能域。

生物信息学方法预测lncRNA的功能始终是一个吸引人的研究方向。在正确预测的基础上进行功能研究可节省时间，少走弯路。因为lncRNA保守性差,对其功能预测难度不小。有以下几种策略。

比较基因组学策略。尽管大部分lncRNA一级和二级结构不保守，仍有小部分是保守的。根据结构保守性可推测功能相似性；

与编码基因进行共表达分析。这是一种应用较广的策略。lncRNA可通过与蛋白的作用行使功能，提示可通过它与mRNA的共表达分析预测其功能。适用于基因组水平的分析。数据来源多为微阵列或高通量测序结果；

通过与miRNA或蛋白的相互作用预测。有些lncRNA的功能与miRNA有关。因此,可通过miRNA推测lncRNA的功能。一些算法如miRcode已提出。另一方面,也可通过评估其潜在的互作蛋白推测其功能。一种在线算法catRAPID可用于预测RNA与蛋白质的相互作用。该算法根据RNA和蛋白质的物理化学性质如二级结构、氢键和范德华力等来评估它们之间相互作用的倾向。这种策略只对部分lncRNA适用。

编辑： hejianxin    来源：丁香园