miRNA功能研究的策略

miRNA功能研究是miRNA研究的重要部分。选择研究方法宜结合研究目的、研究出发点，结合实验材料，选用合适的技术。

一般情况下，检测一下miRNA表达情况是必要的。表达是行使功能的前提。表达的检测是功能研究的基础。检测不同生理状态下的材料miRNA的表达情况，可能会发现研究切入点。正常与病变的样本，经处理和未处理的样本，不同时间处理的样本，不同来源的样本，它们的miRNA（已知的和/或未知的）的表达有什么不同？表达检测，有助于锁定研究对象，可以将具体的miRNA与具体的生理状态（表型）联系起来，从而与功能联系起来。有几种技术可以选用。微阵列技术，可在已知基因中大规模筛选表达差异基因，已发展得很成熟；新一代测序技术，可以高通量地检测已知和未知的miRNA表达差异，可以用于差异基因的初筛；qRT-PCR技术，可以检测某些特定基因的表达水平，尽管通量不高，但敏感特异，简便快速，也用于高通量检测结果的验证；Northern blot，可以用于对新发现的miRNA的验证，但操作烦琐。为增强特异性，现多使用锁核酸(locked nuclei acid，LNA)修饰的杂探针取代传统的DNA探针；原位杂交，是检测在不同空间分布的miRNA及其丰度的技术，尽管实验程序较复杂，但它可提供miRNA行使功能的位置信息。`

    表达检测是一种事后的、间接的将基因与功能联系起来的方法。它可以为miRNA的功能研究提供线索。一些研究方法则比较直接。通过遗传学或非遗传学方法改变基因的表达水平（过表达或沉默）然后观察表型是通行的方法。上调miRNA表达水平观测功能获得型(gain-of-function)表型，而下调或抑制miRNA的表达观测功能丧失型(loss-of-function)表型。尤其是功能丧失研究，可有助于得出功能研究的有力、直接的结论。为了实现较长时间的过表达，可用质粒载体或病毒对miRNA 或miRNA 反义链序列进行过表达。构建过表达质粒时，可以通过PCR 扩增pre-miRNA 发夹结构及一定长度的5’和3’侧翼序列，然后将片段克隆到表达载体上，这种方法依赖Drosha/Dicer 酶对转录本的顺序加工和exportin 5的辅助转运产生活性miRNA。进行短期研究时，可用外源miRNA 双链例如人工合成的 miRNA mimics（模拟物）或反义抑制剂miRNA Inhibitor进行转染。miRNA mimics 和 miRNA Inhibitor的升级产品 miRNA agomir 和 antagomir 与细胞膜亲和力更高，更适合细胞转染和动物体内实验，可以采用全身注射或局部注射等多种方式给药，操作较简便。
  
    建立miRNA转基因动物模型也miRNA功能研究的工具之一。miRNA的表达具有时序和组织特异性，可以用条件基因打靶(conditional gene targeting)构建组织特异的miRNA敲除动物模型。但这种方法比较费时费力。而且，有一些问题需要充分考虑。miRNA基因有冗余性，敲除一个miRNA位点很可能不产生表型改变；许多miRNA是成簇排列的，不容易做到敲除一个miRNA而不影响相邻miRNA的表达。为了抑制miRNA的功能，另一种策略，所谓的miRNA 海绵（miRNA sponge）的技术被提出。miRNA 海绵实际上是有着多个miRNA 结合位点的mRNA，其3’ 非翻译区（UTR）包含若干个miRNA靶定位点。这些靶定位点在RISC切割位点有一些错配。该mRNA不会被降解，可以与RISC稳定结合，并竞争性吸引、隔离miRNA，使其不与mRNA靶点结合。miRNA海绵对家族中亲缘关系接近的所有miRNA都有效，在一定程度上克服了基因冗余性的问题，可对miRNA进行短期或长期的抑制。

    对miRNA靶标的研究也有助于探究其功能。miRNA主要是通过结合其靶标mRNA、抑制其翻译行使其功能的，因而可以通过检测mRNA及蛋白的丰度研究miRNA的调控功能。对于植物，miRNA促进靶mRNA的降解，可通过新一代测序、微阵列芯片或qRT-PCR技术检测mRNA丰度,筛选、验证目标基因；在动物中，miRNA与靶mRNA结合不完全，通常不导致靶mRNA的降解，而是抑制其翻译过程。因此，经过表达或沉默miRNA处理后的细胞，靶mRNA的水平可能是没有变化的。此时可以从蛋白质水平验证靶基因的表达情况。可以用Western blot检测。培养细胞的稳定同位素标记法SILAC(stable-isotope labeling by amino acids in cultured cells) 是一种在翻译过程中标记蛋白的方法。细胞培养后，从中提取蛋白质组进行分析比较，从而定量研究靶基因的表达情况。也有人通过检测测细胞信号转导蛋门磷酸化水平研究miRNA在信号通路中的作用。也可以用荧光素酶报告基因法鉴定miRNA靶基因。

     新一代测序技术也可直接用于靶基因筛查。一个应用的例子是降解组测序(Degradome Sequencing)。它通过对靶mRNA被剪切后的含3’ polyA尾巴的降解片断的测序探测靶mRNA，结合了高通量测序技术与生物信息学分析各自的优势，已被用于一些植物的miRNA 标靶基因筛选。这种技术无法筛选具有翻译抑制功能的miRNA的靶标mRNA。另一个例子是利用Ago蛋白家族抗体的CLIP-seq。

生物信息学分析在miRNA功能研究中有重要的做用。可以对微阵列或新一代测序检测到的miRNA表达谱进行生物信息分析，进行miRNA靶基因预测、Gene Ontology 功能显著性富集分析和pathway显著性富集分析，为揭示功能提供线索。对miRNA靶基因的预测，下面将做较详细的说明。

编辑： hejianxin    来源：丁香园