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TRIzol 是广谱型中 RNA 提取试剂。广泛应用于植物材料、动物组织、细胞及各种微生物等样品中提取 RNA。本试剂能够提取完整的 RNA。加入氯仿离心后,溶液分为三层:上层无色水相、中间层和下层红色有机相,RNA 分布在上层水相中,收集上清层后,经异丙醇沉淀便可以回收得到总 RNA,提取的总 RNA 完整性好,无蛋白和 DNA 污染,可用于各种分子生物学常规实验,如 RT-PCR、Real-timeRT-PCR、NorthernBlot、DotBlot、体外翻译等。 实验试剂: TRIzol(德元国际 Cat LY6151)、无水乙醇、氯仿、异丙醇、75% 酒精、液氮实验用具: 高速离心机、研钵、移液器,离心管,一次性手套、口罩等操作步骤 1.样品处理 1)动物组织:取新鲜或-70℃ 冻存动物组织尽量剪碎,每 30-50 mg 组织加入 1 mlTRIzol(德元国际 Cat LY6151),匀浆仪进行匀浆处理。或在液氮中研磨后加入 TRIzol1 ml(德元国际 Cat LY6151)混匀。 2) 植物组织:取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在 TRIzol(德元国际 Cat LY6151)中迅速研磨,每 30-50 mg 组织加入 1 mlTRIzol,混匀。 3)单层培养细胞:吸去培养液,加入适量 TRIzol(每 10 cm2 面积 1 mlTRIzol),反复吹打使细胞裂解。如果 TRIzol 的量不足可能导致 RNA 中有 DNA 污染。 4)细胞悬液:不洗涤细胞,直接离心收集细胞。每 5×106-1×107 动物、植物和酵母细胞或每 107 细菌细胞加入 1 mlTRIzol(德元国际 Cat LY6151)。 可选步骤:当样品富含蛋白质,脂肪,多糖或是细胞外物质例如肌肉,脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在 2~8°C 的条件下以 12,000×g 的离心力离心 10 min,移除匀浆中不溶解的物质,余下的沉淀中包含有细胞外膜,多糖,以及高分子量 DNA,而 RNA 存在于上清中。对于脂肪组织的样品中,大量的脂肪漂在最上层也应该除掉。吸取上清备用。 2.将匀浆样品反复吹打几次,在室温条件下静置 5 min,使蛋白核酸复合物完全分离。 3.向以上溶液中加入氯仿,每使用 1 mlTRIzon 加入 0.2 ml 氯仿,盖好管盖,剧烈振荡 15 秒,室温放置 2-3 min. 4.4℃ 12,000 rpm 离心 15 min,此时样品分成三层:红色有机相,中间层和上层无色水相,RNA 主要在水相中,把水相(约 600μl)转移到一个新的离心管(自备)中。 5.在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置 10 min. 6.4℃ 12,000rpm 离心 10 min,弃上清。 7.加入 75% 乙醇(用无 RNase 的水配制)洗涤沉淀。每使用 1 mlTRIzol 用 1 ml75% 乙醇对沉淀进行洗涤一次。 8.4℃ 12,000rpm 离心 3 min,小心吸弃上清,注意不要吸弃 RNA 沉淀。 9.室温放置 3-5 min,晾干。加入 30-100μl 无 RNase 的水,充分溶解 RNA,得到的 RNA 保存在-70℃,防止降解。 注意:沉淀不要过分干燥,以免难于溶解。 |