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聚合酶链式反应(PCR)

标签: 聚合酶 链式反应 PCR

PCR技术可用于:(1)检验感染性疾病是否处于隐性或亚临床状态;(2)有效检测癌基因的突变,准确检测癌基因的表达量;(3)临床应用于检测地中海贫血的基因突变。

详细
实验方法
  • PCR技术
实验方法原理
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
 
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:

①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;
 
②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
 
③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
 
重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤

一、标准的PCR反应体系
 

10×扩增缓冲液     10 ul
 
4种dNTP混合物   各200 umol/L
 
引物            各10~100 pmol
 
模板DNA      0.1~2 ug
 
Taq DNA聚合酶    2.5 u
 
Mg2+       1.5 mmol/L
 
加双或三蒸水至    100 ul
 
二、PCR引物设计

PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

1.   引物设计的基本原则

(1)  引物长度:15-30 bp,常用为20 bp左右。

(2) 引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

(3) 引物内部不应出现互补序列。
 
(4)两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3 ′端的互补重叠。
 
(5) 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
 
(6)引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。

(7) 引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。

2.   引物设计软件

Primer Premier5.0 (自动搜索)*、Oligo6 (引物评价)、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 (在线服务)。

三、模板的制备

(1)PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。

(2)模板的取材主要依据PCR的扩增对象,可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

(3)标本处理的基本要求是除去杂质,并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌,可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA,经酚、氯仿抽提纯化,再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

四、PCR反应条件的控制

1.  PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。 

2.  镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高,常用1.5 mmol/L。
  
3.  底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制,20~200 umol/L。
 
4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。
  
5.  引物 浓度一般为0.1 ~0.5 umol/L。
 
6.  反应温度

(1)变性温度和时间95℃,30 s。

(2)退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。

(3)延伸温度和时间72℃,1 min/kb(10 kb内)。

(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)

7.  循环次数 :一般为25 ~30次。循环数决