一、制备生物素化DNA
将噬粒 BLuescript skt,用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280 bp DNa段,即为生物素化DNA。
二、免疫PCR模式
1. 试剂
包被缓冲液:20 mmol/L Tris-HCI(pH9.5),含150 mmol/L NaCl和0.02%NaN3;
洗涤液:20 mmol/L Tris-HCI(pH7.5),含150 mmol/LNaCl 0.1 mmol/L EDTA和0.1%Tween20;
稀释液:20 mmol/L Tris-HCI(pH7.5),含150 mmol/L NaCl 0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA (0.1 mg/ml)。
2. 操作
(1) 包被
用包被缓冲液稀释抗原(BSA),加入微滴板中(45 μl孔),4℃过夜(约15 h),用洗涤液洗板3次×5 min。
(2) 封闭
每孔加200 μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA(1 mg/ml)、0.1 mmol/L EDTA的20 mmol/L Tris-Hcl(pH7.5)(含150 mmol/L NaCl缓冲液,37℃温育80 min,洗板数次。
(3) 抗原抗体反应
用释释液1:8 000稀释单克隆抗BSA抗体,每孔加50 μl,室温(22℃)下45 min,洗板孔15次×10 min,去除未结合的抗体分子。
(4) 链亲合一蛋白A结合反应
每孔加入50 μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体,室温(22℃)50 min,使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上,然后洗板15次×10 min,再用无NaN3的TBS洗3次,然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。
(5) PCR
实验条件 50 mmol/L KCI、10 mmol/L Tris-HCI(20℃pH8.3)、1.5 mmol/LMgCl2、明胶(10 μg/ml)、0.8 mmol/LdNTPs(每种0.2 mM)、2 μM引物(每一引物1 μM)和TaqDNA多聚酶(50 U/ml)。
三、PCR周期
PCR前,用紫外线(UV)(254 nm)照射上述反应混合物,然后将之加入到微滴板孔中,每孔40 μl,再加20 μl UV照射的石蜡覆盖,按下述温度在PCR仪上进行PCR周期:起始变性94℃5 min;30个周期:变性94℃5 min,退火58℃1 min,延伸72℃1 min,最后延伸72℃ 5 min,得到的PCR产物为特定的261 bp的片段。
1. 用0.85% NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度;
2. 加50 μl于微孔板内,4℃过夜。同时设阴性对照(加50 μl 0.85% NaCl于另一孔内);
3. 用400 μl的0.05% 温20pBS(以下简称TPBS),洗涤五次;
4. 加入2.25%的100 μl正常山羊血清(NGS) PBS封闭2小时;
⒌ 用含0.15% NGS的TPBS洗3次;
6. 加入100 μl用0.75% NGS适当稀释的单克隆抗体(内含100 μg的鲜鱼精DNA),室温孵育30 min;
7. 用TPBS洗涤五次;
8. 加入50 μl适量稀释的生物素化抗鼠IgG抗体,室温孵育30 min;
9. 用TPBS洗涤五次;
10. 加入60 μl适量稀释的生物素化DNA和亲和素,室温孵育30 min;
11. 用TPBS洗涤五次,再用HPLC级水洗三次;
12. PCR扩增:加入50μl PCR反应液(内含T3和T7引物),95℃ 60 s,50℃ 110 s,72℃ 110 s,循环30次。取PCR产物10 μl于1.7%琼脂糖凝胶上电泳,和核酸分子量标准相比较,在相应的位置邮现电泳带为阳性。必需时将电泳结果照像,进行定量分析。
|