来源: 实验万事屋
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是不是做 Western 的时候,会遇到这样的情况呢?
没错,就是背景很脏。造成背景脏的原因有很多,比如一抗没洗干净,或者二抗没洗干净,还有就是封闭的时候不完全。但其实,封闭液也是你们很容易忽略的一个环境哈。
封闭液有几种?除了脱脂奶粉和 BSA 还有啥你们能想到的?
第一种封闭液就是脱脂奶粉,这是异常便宜的封闭液品种,当然也应该是你们最常用的封闭液配方了。(甚至我们用过特仑苏)
但是,你们应该注意到的是,脱脂奶粉中有大量的生物素,也就是说你做的蛋白要是用生物素标记的,一抗也是抗生物素的。那用脱脂奶粉封闭,就会背景脏得不得了。还有一点就是脱脂奶粉的 IgG 能和抗山羊的二抗有交叉反应……所以……
第二种封闭液就是 BSA,这个相对来说贵一些,一般会用于一些磷酸化的 WB 里。但是,有些 BSA 偶联的多肽要做 WB 的话,就绝对不能用 BSA 作为封闭液。
第三种封闭液估计你们不会特别常用,其实就是吉利丁,做过布丁或者慕斯蛋糕的同学可能知道这是啥。其实就是 Fish Gelatin,鱼明胶,但是这种封闭液成分价钱很傲娇,所以平时没什么人会使用这个。
还有一种比较常用的封闭液,就是 0.25 - 2% 的吐温 20(Tween- 20)。其实吐温是一种温和的蛋白变性剂,所以作为封闭液的话,有可能会导致一些蛋白的脱落,在结果中清除少量的蛋白质,有时候也会有一些残留的本底。当然,优点是由于吐温不是蛋白,所以可以在抗原检测后再进行染色。
其实选对了封闭液,在 WB 实验中也是非常关键的。这需要你在实验前先了解实验的目的以及实验所涉及的蛋白。当然,关键还要看老板的荷包。一般来说,5% 脱脂奶粉溶于 0.2% 吐温 20 /PBS 中(w/v)也是个不错的配方哦。
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