解答:这个问题比较宽泛,也没有标准的答案,我们只能结合目前的一些经验说一下。我们义翘神州经过十多年的重组蛋白表达,在细胞、载体及培养基等整体表达体系都进行了优化。经过优化的体系,HEK293 瞬转表达重组蛋白体系的细胞密度要高于 CHO 细胞,所以在蛋白表达量方面,HEK293 瞬转表达的重组蛋白要比 CHO 更好一些。但在蛋白的修饰和活性方面,我们目前还没有发现明显的差异。
3. 用合成的 300bp 片段基因,蛋白怎么都表达不出来怎么办?
解答:首先需要确定,这段合成的基因片段有没有经过密码子优化?是不是要在大肠杆菌中表达蛋白呢?如果已经做过密码子优化,也是要在大肠杆菌中表达,并且确定该蛋白不会对细胞有毒性,那我们可以尝试在 N 端加标签,或者更换启动子、菌株。然后也可以对大肠杆菌的培养条件以及诱导条件的参数(如温度、时间)进行优化。如果是毒性蛋白,则建议尝试获得包涵体的条件。如果使用真核细胞表达蛋白,由于表达体系比较复杂,需要结合具体的表达系统具体分析。也可以跟义翘神州的技术支持人员进行详细的沟通。
4. 用 293F 表达时常遇到蛋白无法分泌,有好的尝试方法吗?信号肽、培养基、培养添加物?
解答:这个情况我们也会经常遇到,我们一般会首选使用蛋白自身的信号肽进行蛋白的表达。在自身信号肽无法分泌的时候,我们尽量会尝试用一些高分泌的信号肽添加在这个蛋白的 N 端,然后进行蛋白分泌。另外可以考虑的一种情况,如果你发现目的蛋白在胞内有一定量的表达,只是没有分泌出来的话,很可能跟目的蛋白的修饰和折叠有一定的关系。我们一般会考虑,尽量将温度降低,让它的表达或者细胞增值的速度尽量缓慢,给蛋白的后修饰提供更多的时间,让它进行完整的修饰,从而对蛋白的结构和折叠有一个促进作用,可以尝试这样的方法是否有效。