1. DNA模板的质量问题 a. 模板提取不完整,其中不含你的目的基因,或目的基因含量太低。这个情况下应该使用较为新鲜的样本以及较为温和的提取方法来降低DNA模板因在提取过程中损伤情况。 b. 模板里面残留某种试剂成份,可能抑制Taq聚合酶的活性,如果是这种情况,可以用试剂盒把模板再纯化一下,或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。
2. DNA聚合酶的影响 a. Taq酶具有较高的错误率,导致产物3’端出现错配碱基,DNA合成提前结束。这时应该使用一些错配率更低的耐热聚合酶,如klentaq、pfu、rTth、Vent等。从不同文献中可以得到使用双酶系统更有利于长片段DNA的合成。 b. Taq酶在PCR的过程中活力下降,会增加非特异扩增以及二聚体的出现。这时应该使用缓冲能力较强的缓冲液,使缓冲液的pH值不会降得过低而影响酶活性;也可在PCR体系中添加一些促进剂,以降低退火温度或/和提高聚合酶的稳定性,从而促进长片段扩增的进行;也可稍微降低变性温度,以保证聚合酶的活性。
4. 引物问题 a. 样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好,而和另一些基因型结合不好。可以设计一对更保守的引物试试。 b. 引物设计的不好,会导致二聚体出现、非特异性扩增或无法扩增。长片段PCR的引物设计原则和普通PCR一样,只是较长一些(21-34个核苷酸),以便提高退火温度,从而提高反应的特异性。但也不要太长,以免引物间互补形成二聚体。