关键词: 腺病毒 EGFP基因 神经干细胞
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1.1 动物
1.2 主要试剂和仪器
1.3.1 NSCS的分离、培养及鉴定
取新生大鼠置于0.5%碘伏中消毒,取脑,分离海马,剥离脑膜血管,将海马组织移入含有2%B27的高糖DMEM/F12培养液中,尽量将组织剪碎,轻轻吹打制成细胞悬液,400目筛网过滤,台盼蓝染色,细胞计数,以2×106个/L接种到6孔培养板内,最后加入EGF(终浓度20 μg/L)和bFGF(终浓度20 μg/L),置37℃、5%CO2平衡湿度培养箱中。
每2~3天半量换液1次,每7~10天传代1次。对第3代培养7天的细胞球参照文献[3]用Nestin免疫荧光染色法进行鉴定,荧光倒置相差显微镜观察拍照。
1.3.2 Ad/EGFP转染NSCS
把第3代培养7天的细胞按2×105个/孔接种到24孔板,每孔加入DMEM/F12+EGF+bFGF培养液1 ml,转染前1天半量换液。实验分为5组,感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为0∶1(对照组)、10∶1、20∶1、50∶1、100∶1,每组设8孔。根据感染复数计算加入所需腺病毒悬液的体积数,在EP管中将所需的腺病毒悬液与无血清的DMEM/F12培养液混合,将混合液按照分组分别加入到每组细胞中,每孔0.2 ml。
将24孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养,4 h后用DMEM/F12清洗细胞2次,弃病毒残液。每8 h观察EGFP的表达情况,常规半量换液。转染后48 h,在200倍荧光显微镜下,随机选取5个视野,分别计算绿色荧光阳性细胞百分数,用以代表Ad/EGFP对NSCS的转染效率。
1.3.3 Ad/EGFP体外转染对神经干细胞增殖的影响
1.3.4 Ad/EGFP体外转染对神经干细胞分化的影响
1.4 统计学处理
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